Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

We zouden graag bedanken CSIC voor de financiële steun aan dit project, Mariana Di Doménico voor haar technische bijstand met confocale microscopie; naar José Leonardo Báez voor zijn manuscript correcties; naar Luciano Correa voor zijn toewijding aan de oprichting van de video; voor Natalia Rosano voor leningen van haar stem voor de video en de Bloomington Drosophila voorraad Center voor het verstrekken van de voorraden in deze studie gebruikt. De Apa1 monoklonaal anti-Ptc ontwikkeld door Isabel Guerrero was verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, afdeling biologische wetenschappen, Iowa City, IA 52242.

Dag 1
1. verzamelen en kweken van poppen.
<ol>
	<li>Verwijderen 0 h na de vorming van de puparium (APF) of prepupae met behulp van een natte penseel uit gekweekte flesjes en plaats ze in nieuwe flesjes om bijna volledige periode van de ontwikkeling (zie 2.1 en 2.2). 
	Opmerking: Een gezonde bevolking van vliegen, moet worden gehandhaafd met kweken standaardprotocollen. Na drie of vier dagen waarin de eieren worden gelegd, kunnen de volwassenen uit flesjes om een optimale on...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

De methode van dissectie beschreven in deze video kan worden gebruikt om hoge kwaliteit monsters van Drosophila pop vleugels uit verschillende ontwikkelingsstadia voor vele soorten technieken (bijvoorbeeld, immunofluorescentie, cDNA synthese voor PCR bepalingen, in vitro vleugel ontwikkeling). In termen van deze methode hebben de betrokken wetenschapper 24-30 h APF gebruikt. Echter er moet niet worden gehinderd in de essentiële stappen in dissectie van jonger of ouder Verpopping. Veranderinge...

Drosophila vleugels zijn ontwikkeld op basis van de vleugel imaginaire schijven. De primordiale van deze vleugel schijven zijn opzij zetten tijdens de embryonale ontwikkeling als kleine groepen van 20-30 imaginaire cellen die van de embryonale epitheel invaginate. Terwijl de larve naar de derde fase van de instar groeit, optreden mitose in de imaginaire cellen op specifieke karakteristiek tijden het verhogen van de nummers (ongeveer 50000 cellen) en de vorming van de vleugel disc1,2,3, 4. Als de cellen verspreiden, mode ze een tubulaire epitheel, resulterend in een zelf vouwen compacte spiraal. Tijdens verpopt, de schijf epitheel telescopen uit aan de twee-gelaagde vorm wing en de longitudinale aders beginnen als lacunes tussen hen, die tweemaal tijdens vleugel developmental5,6optreedt.
De rangschikking van de aderen altijd heeft een identieke patroon; de mogelijkheid om gemakkelijk identificeren dat bij iedere wijziging in de aderen vorming maakt mutaties uiterst zichtbaar (bijvoorbeeld ontbrekende of extra aderen, veranderingen in de ader posities, enz.). Interessant is dat zijn het fenotype variaties meestal het bewijs van mutaties in bekende of nieuwe onderdelen van signalering van trajecten die relevant voor de ontwikkeling van de vleugel zijn. Een van de trajecten die speelt een rol bij het bepalen van de positie en onderhouden ader en intervein gebieden is de egel (Hh) traject6,7,8.
Gezien het belang van de pop vleugel als een modelsysteem, is het belangrijk om goede kwaliteit te werken met monsters. In het verleden, hebben de wetenschappers die protocollen voor het ontleden van Drosophila vleugels hebben gepubliceerd een passende gids voor het bereiken van werkbare monsters niet gegeven. Zonder begeleiding van een onderzoeker kan niet een duidelijk visualiseren van het proces. In deze alternatieve ontleden benaderingen is de verpopping gesplitst in twee, het scheiden van de vleugel van het omliggende weefsel en herhaaldelijk gewassen om te verwijderen van het puin. Dit soort benadering vorderingen te verlaten de vleugel gratis verontreinigt maar als gevolg van eerdere ervaring het proces is langzamer en is er een hogere kans van de structuur van de breekbare vleugels9in gevaar te brengen.
De hier beschreven procedure werd ontwikkeld door de vraag te vinden van een snelle en efficiënte werkwijze te halen pop vleugel monsters geschikt specifieke proteïnen of afschriften met behulp van immunodetection protocollen of polymerase kettingreactie (PCR) tests op te sporen. Om te illustreren de expressie en de lokalisatie van Patched (Ptc of de canonieke receptor van het leertraject Hh) wordt aangetroffen in pop vleugel monsters, bieden een protocol waarin de relevante details met succes uit te voeren voor de volledige procedure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Vleugel ontwikkeling bij Drosophila melanogaster is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese weefsel niveau. Deze aanhangsels ontwikkelen uit een groep van cellen met de naam imaginaire schijven vleugel gevormd tijdens de embryonale ontwikkeling. In de larvale stadia groeien de imaginaire schijven, verhoging van het aantal cellen en de vorming van monolayered epitheliale structuren. In de pop behuizing, de imaginaire schijven bud uit en vouw in bilayers langs een lijn die de toekomstige marge van de vleugel wordt. Tijdens dit proces zijn de longitudinale primodia aderen afkomstig ader cellen op de potentiële dorsale en ventrale oppervlak van de vleugel. Tijdens het popstadium communiceren de strepen van ader cellen van elk oppervlak om het genereren van strakke buizen; op hetzelfde moment beginnen de Kruis-aders hun vorming.
Met behulp van passende moleculaire merkers is het mogelijk om de belangrijke elementen samenstellen van de vleugel tijdens zijn ontwikkeling te identificeren. Om deze reden is de mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in deze structuur cruciaal voor het bestuderen van hun overvloed en localisatie verbonden met het ontwikkelingsproces van de vleugel.
De procedure beschreven hier richt zich op het manipuleren van pop vleugels, het verstrekken van gedetailleerde instructies over hoe om te ontleden de vleugel tijdens het popstadium. De dissectie van pop weefsel is moeilijker uit te voeren dan hun tegenhangers in derde instar-larven. Dit is de reden waarom deze aanpak werd ontwikkeld, om snelle en efficiënte hoge kwaliteit monsters krijgen. Details over het immunokleuring en mount deze vleugel monsters, dat de visualisatie van proteïnen of celbestanddelen, vindt u in het protocol. Met weinig deskundigheid is het mogelijk om te verzamelen van 8-10 hoge kwaliteit pop vleugels in een korte hoeveelheid tijd.

Het protocol biedt een eenvoudige methode voor het verkrijgen van pop vleugel monsters met behoud van de vertrouwde morfologie van de vleugel. Vanaf deze preparaten is het mogelijk om stapels van beelden die geprojecteerd kunnen worden als 2D- of 3D, te onderzoeken van de distributie en/of de verrijking van proteïnen bij de differentiatie van de vleugel. Een vergelijkbaar protocol kan (Zie de opmerking in 2.9) worden gebruikt voor het verzamelen van het monster van de grote pop vleugel (...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).

Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Een snelle en efficiënte methode voor het zuiveren van Endoderm Cellen Generated van menselijke embryonale stamcellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cel aggregatie testen om te evalueren van de Binding van de Drosophila inkeping met Trans-liganden en haar remming door Cis-liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissectie van de Drosophila pop netvlies voor Immunohistochemistry, westelijke analyse en RNA isolatie

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...