Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Nous tenons à remercier la SCCI pour le soutien financier accordé à ce projet, Mariana Di Doménico pour son aide technique à la microscopie confocale ; pour José Leonardo Báez pour ses corrections du manuscrit ; à Luciano Correa pour son dévouement à la création de la vidéo ; pour Natalia Rosano pour prêter sa voix pour la vidéo et la drosophile Bloomington Stock Center pour fournir les stocks utilisés dans cette étude. Le Apa1 anticorps monoclonal anti-Ptc développé par Isabel Guerrero a été obtenu de la Banque du développement de hybridome études (DSHB) sous les auspices de la NICHD et maintenu par le Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.

Jour 1
1. collecte et mise en culture de pupes.
<ol>
	<li>Enlever 0 h après formation puparium (APF) ou prénymphes avec un pinceau humide de flacons de culture et placez-les dans des flacons de nouveau à presque totale de la période de développement (voir 2.1 et 2.2). 
	Remarque : Une population saine de mouches devrait être maintenue à l’aide de protocoles standard de la culture. Après trois ou quatre jours où les oeufs sont pondus, les adultes peuvent être su...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

La méthode de dissection décrite dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des échantillons de haute qualité des ailes pupes drosophile de stades de développement différents pour de nombreux types de techniques (p. ex., immunofluorescence, synthèse de cDNA de tests de PCR, in vitro développement d’aile). En ce qui concerne cette méthode, les scientifiques impliqués ont utilisé 24-30 h CSA. Il ne faut cependant aucun obstacle dans les étapes essentielles dans la dissec...

Ailes de drosophile sont élaborés selon les disques imaginaux de l’aile. Primordial de ces disques alaires sont mis de côté durant le développement embryonnaire en petits groupes de 20 à 30 cellules imaginal qui invaginent de l’épithélium embryonnaire. Tandis que la larve se développe à la troisième phase de stade larvaire, la mitose se produit dans les cellules imaginal à des moments précis caractéristiques augmenter ses effectifs (environ 50000 cellules) et formant l’aile disque1,2,3, 4. Comme les cellules prolifèrent, ils mode un épithélium tubulaire, résultant en une spirale automatique pliage compacte. Au cours de la nymphose, l’épithélium disque télescopes sur aile forme les deux couches et les nervures longitudinales commencent comme lacunes entre eux, qui se produit deux fois au cours de l’aile du développement5,6.
L’arrangement des veines toujours présente un motif identique ; la capacité de facilement identifier chaque altération dans la formation de veines rend extrêmement visible des mutations (p. ex. manquant ou défectueux veines, changements dans la veine des postes, etc..). Fait intéressant, les variations de phénotype sont généralement la preuve des mutations dans les éléments connus ou nouveaux de la signalisation des voies qui sont pertinentes pour le développement de l’aile. Une des voies qui joue un rôle dans la détermination de la position et de maintenir la veine et territoires intervein est le Hedgehog (Hh) voie6,7,8.
Compte tenu de l’importance de l’aile de nymphe comme système modèle, il sera important d’obtenir des échantillons de bonne qualité pour travailler avec. Dans le passé, les scientifiques qui ont publié les protocoles pour disséquer Drosophila ailes n’ont pas donné un guide approprié pour atteindre échantillons réalisables. Sans l’aide d’un chercheur, on ne peut pas visualiser clairement le processus. Dans ces autres approches dissection la pupe est scindée en deux, séparant l’aile du tissu environnant et lavée à plusieurs reprises pour enlever les débris. Ce genre d’approche des revendications de quitter l’aile libre de contaminants, mais en raison de l’expérience précédente, le processus est lent et il n’y a plus de chances de compromettre la structure des ailes fragiles9.
La procédure décrite ici a été développée par l’exigence de trouver une méthode rapide et efficace d’obtenir des échantillons de pupes aile adaptés détecter les protéines spécifiques ou relevés de notes à l’aide de protocoles immunodétection ou polymerase chain reaction (PCR) essais. Pour illustrer ceci, l’expression et la localisation de Patched (Ptc ou le récepteur canonique de la voie de Hh) est détecté dans des échantillons d’ailes pupal, fournir un protocole qui inclut des détails pertinents pour mener à bien la complète mode opératoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Développement d’aile chez Drosophila melanogaster est un modèle idéal pour l’étude de la morphogénèse au niveau des tissus. Ces appendices se développent à partir un groupe de cellules nommées disques imaginaux aile formées pendant le développement embryonnaire. Dans les stades larvaires les disques imaginaux croître, augmentant son nombre de cellules et formant des structures épithéliales examen. À l’intérieur de la pupe, les disques imaginaux IUN dehors et incorporer des bicouches le long d’une ligne qui devient la future marge de l’aile. Au cours de ce processus, les veines longitudinales primodia proviennent de cellules sur la surface dorsale et ventrale prospective de l’aile. Durant le stade pupal les rayures des cellules de la veine de chaque surface communiquent afin de générer des tubes serrés ; dans le même temps, les croix-veines commencent leur formation.
Avec l’aide de marqueurs moléculaires appropriées, il est possible d’identifier les principaux éléments composant l’aile durant son développement. Pour cette raison, la capacité de détecter avec précision les transcriptions ou protéines dans cette structure est essentielle pour l’étude de leur abondance et la localisation liées au processus de développement de l’aile.
La procédure décrite ici se concentre sur la manipulation des ailes pupes, donnant des instructions détaillées sur la manière de disséquer l’aile pendant le stade pupal. La dissection des tissus nymphal est plus difficile à réaliser que leurs homologues au troisième stade larvaire. C’est pourquoi cette approche a été développée, pour prélever des échantillons de qualité rapide et efficace. Comment réagissent et monter ces échantillons d’aile, afin de permettre la visualisation des protéines ou des composants de la cellule, sont indiquées dans le protocole. Avec peu d’expertise, il est possible de collecter des ailes pupal de 8-10 de haute qualité dans un court laps de temps.

Le protocole propose une méthode simple pour obtenir des échantillons de pupes aile qui conservent la morphologie familier de l’aile. De ces préparations, il est possible d’obtenir des piles d’images qui pourraient être projetés en 2D ou en 3D, pour étudier la distribution ou l’enrichissement des protéines au cours de la différenciation de l’aile. Un protocole similaire (voir la note à 2.9) peut être utilisé pour recueillir l’échantillon de grande aile pupe (ailes ...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

La capacité de détecter avec précision les relevés de notes ou de protéines dans les tissus de la drosophile est critique pour étudier leur abondance et leur localisation liées au processus de développement. Voici la description d’une procédure simple pour disséquer les ailes pupes. Ces ailes peuvent être utilisées comme échantillons dans plusieurs techniques (immunohistochimie, PCR assay, etc.).

Une méthode rapide et efficace de disséquer les ailes Pupal de Drosophila adapté aux Immunodetections ou des analyses par PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

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