Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Wir würden gerne CSIC danken für die finanzielle Unterstützung für dieses Vorhaben, Mariana Di Doménico für ihre technische Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie; für José Leonardo Báez für sein Manuskript Korrekturen; an Luciano Correa für sein Engagement für die Erstellung des Videos; für Natalia Rosano für die Kreditvergabe ihre Stimme für das Video und die Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung der Bestände, die in dieser Studie verwendet. Die Apa1 monoklonalen Anti-Ptc entwickelt von Isabel Guerrero war erhalten von Entwicklungsstörungen Studien Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft der NICHD und vom Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242 gepflegt.

Tag1
1. Erhebung und Kultivierung Puppen.
<ol>
	<li>0 h nach Puppenkammer Bildung (APF) oder Prepupae mit einem nassen Pinsel aus kultivierten Fläschchen entfernen und legen Sie sie in neue Fläschchen die Entwicklungszeit fast abgeschlossen (siehe 2.1 und 2.2). 
	Hinweis: Eine gesunde Population von Fliegen mit Kultivierung Standardprotokolle aufzubewahren. Nach drei oder vier Tagen die Eiablage, können die Erwachsenen Fläschchen erlauben eine optimale Entwicklung der I...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Die Methode der Dissektion in diesem Video beschrieben kann zur Vorbereitung hochwertige Proben von Drosophila pupal Flügel aus verschiedenen Entwicklungsstufen für viele Arten von Techniken (z. B. Immunfluoreszenz, cDNA Synthese zu PCR-Assays, in-vitro- Flügel Entwicklung). In Bezug auf diese Methode der beteiligten Wissenschaftler nutzten 24-30 h APF. Es sollte jedoch kein Hindernis in die wesentlichen Schritte in Dissektion der jüngere oder ältere Puppe. Änderungen müssen vorgenommen...

Drosophila Flügel werden aus den Flügel imaginalen Scheiben entwickelt. Das ursprüngliche dieser Flügel Discs während der Embryonalentwicklung als kleine Gruppen von 20-30 imaginalen Zellen, die aus embryonalen Epithel Biomembran beiseite. Während die Larve in die dritte Stufe der Instar wächst, tritt Mitose in die imaginalen Zellen zu bestimmten charakteristischen Zeiten heben seine Zahlen (ca. 50000 Zellen) und bilden die Flügel1,2,3Disc, 4. Da die Zellen sich vermehren, Mode sie eine röhrenförmige Epithel, was zu einer selbst faltbare kompakte Spirale. Während der Verpuppung die Scheibe Epithel Teleskope Form der zweischichtigen Flügel und die longitudinalen Venen beginnen als Lücken zwischen ihnen, dem tritt zweimal während Flügel Entwicklungsstörungen5,6.
Die Anordnung der Adern immer hat eine identische Muster; die Möglichkeit auf einfache Weise jede Veränderung innerhalb der Venen-Formation macht Mutationen extrem sichtbar (z.B. fehlende oder zusätzliche Adern, Änderungen in der Vene Positionen, etc..). Interessanterweise sind die Phänotyp-Variationen in der Regel der Nachweis von Mutationen in bekannten oder neuen Komponenten der Signalwege, die für Flügel Entwicklung relevant sind. Die Wege, die eine Rolle bei der Bestimmung der Position und Pflege Vene und intervein Gebiete gehört der Igel (Hh) Weg6,7,8.
Angesichts der Bedeutung der pupal Flügel als Modellsystem, wird es wichtig, gute Qualitätsproben mit arbeiten zu erhalten sein. In der Vergangenheit haben Wissenschaftler, die Protokolle, um Drosophila Flügel sezieren veröffentlicht haben einen passenden Guide, praktikable Proben zu erreichen nicht gegeben. Ohne die Führung eines Forschers kann nicht eindeutig den Prozess zu visualisieren. In dieser alternativen sezierenden Ansätze ist Puppe aufgeteilt in zwei, trennt die Flügel aus den umliegenden Gewebe und wiederholt gewaschen, um die Ablagerungen zu entfernen. Diese Art von Ansatz Ansprüche lassen die Flügel frei von Verunreinigungen, aber aufgrund der bisherigen Erfahrungen ist des Prozess langsamer und gibt es eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Beeinträchtigung der Struktur der zerbrechlichen Flügeln9.
Die hier beschriebene Vorgehensweise wurde von der Nachfrage, eine schnelle und effiziente Methode pupal Flügel Proben geeignet, um bestimmte Proteine oder Abschriften mit Immunodetection Protokolle oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays erkennen erhalten finden entwickelt. Zur Veranschaulichung, der Ausdruck und die Lokalisierung von flickte (Ptc oder den kanonischen Rezeptor des Hh-Signalwegs) in pupal Flügel Proben, Bereitstellung eines Protokolls, die relevanten Details erfolgreich durchzuführen die komplette enthält erkannt wird Verfahren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Flügel-Entwicklung in Drosophila Melanogaster ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese Gewebe Ebene. Diese Anhängsel entwickeln sich aus einer Gruppe von Zellen benannt Flügel imaginalen Scheiben gebildet während der Embryonalentwicklung. In die Larvenstadien wachsen die imaginalen Scheiben, Erhöhung der Anzahl der Zellen und monolayered epitheliale Strukturen bilden. Im Inneren der pupal Fall die imaginalen Scheiben Knospe heraus und Falten in Bilayer entlang einer Linie, die die künftige Marge des Flügels wird. Während dieses Prozesses stammen die longitudinale Primodia Venen Vene Zellen auf den zukünftigen dorsalen und ventralen Flächen des Flügels. Während das Puppenstadium kommunizieren die Streifen der Vene Zellen jeder Fläche um die enge Röhren zu generieren; zum gleichen Zeitpunkt beginnen die Kreuz-Venen ihrer Entstehung.
Mit Hilfe von entsprechenden molekularen Markern ist es möglich, die wichtigsten Elemente des Flügels während seiner Entwicklung zu komponieren zu identifizieren. Aus diesem Grund ist die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in dieser Struktur erkennen kritischer für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess des Flügels.
Die Vorgehensweise hier konzentriert sich auf Manipulation pupal Flügel, eine ausführliche Anleitung zum Umgang mit den Flügel während das Puppenstadium zu sezieren. Die Zerlegung des pupal Gewebe ist schwieriger durchzuführen als ihre Gegenstücke in Dritte Instar Larven. Deshalb ist dieser Ansatz entwickelt wurde, um schnell und effizient hochwertige Proben zu erhalten. Details wie Immunostain und montieren diese Flügel Proben ermöglichen die Visualisierung von Proteinen oder Zellbestandteile, im Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Mit wenig Erfahrung ist es möglich, 8-10 hochwertige pupal Flügel in kurzer Zeit zu sammeln.

Das Protokoll bietet eine einfache Methode für den Erhalt der pupal Flügel-Proben, die die vertraute Morphologie des Flügels zu behalten. Von diesen Vorbereitungen ist es möglich, Stapel von Bildern zu erhalten, die als 2-D oder 3-d, zu untersuchen, Verbreitung und/oder die Anreicherung von Proteinen während der Differenzierung des Flügels projiziert werden konnte. Ein ähnliches Protokoll (siehe Anmerkung in 2,9) lässt sich die große pupal Flügel-Probe (mit 50-80 pupal Flügel) ...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

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The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

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