Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

우리는 CSIC confocal 현미경 검사 법;와 그녀의 기술 지원에 대 한 마리 디 Doménico를이 프로젝트에 주어진 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 그의 원고 교정;에 대 한 호세 레오나르도 Báez를 루치아노 코레아 비디오;의 창조에 그의 헌신을 비디오에 대 한 그녀의 목소리와 블루밍턴 초파리 재고 센터 제공 하는이 연구에 사용 하는 주식에 대 한 대출에 대 한 나탈리 아 Rosano 하. 이사벨 게레로 의해 단일 클로 널 항-Ptc 개발 Apa1에서는 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)는 NICHD의 후원을 얻은 고 아이오와의 대학, 생물학 학과, 52242 아이오와 시, IA에 의해 유지.

주 1
1. 수집 및 경작 번데기입니다.
<ol>
	<li>Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조). 
	참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야...

초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크1,2,3, 4. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달5,6동안 두 번 발생 합니다.
항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에서 변화.) 합니다. 흥미롭게도, 표현 형 변이 일반적으로 신호 경로 날개 개발와 관련 된 알려진 또는 소설 구성에 돌연변이의 증거. 경로 위치를 결정 하 고 정 맥 및 intervein 영토를 유지 하는 역할을 수행 중 이다 Hedgehog (Hh) 통로6,,78.
모델 시스템으로 번데기 날개의 중요성을 감안할 때, 그것은 함께 작동 하도록 좋은 품질 샘플을 얻기 위해 중요 한 됩니다. 과거에는, 날개 초파리 해 부 프로토콜 게시 과학자 하지 실행할 수 있는 샘플을 달성 하기 위해 적절 한 가이드를 주었을 합니다. 연구원의 지도 없이 하나 명확 하 게 과정을 시각화 수 없습니다. 이러한 대체 해 접근 번데기 2, 조직 주위에서 날개 분리 분할 이며 반복적으로 파편을 제거 하기 위하여 세척. 이런이 종류의 자유로운 날개를 두고 접근 주장의 오염 하지만 이전 경험 때문에 프로세스는 느린 고 연약한 날개9의 구조를 손상의 더 높은 기회가 있다.
여기에 설명 된 절차를 특정 단백질 또는 사본 immunodetection 프로토콜 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험을 사용 하 여 적합 한 번데기 날개 샘플 받는 신속 하 고 효율적인 방법을 찾을 수 수요에 의해 개발 되었다. 이 표현과 패치 (Ptc 또는 Hh 통로의 정식 수용 체)의 지역화를 설명 하기 위해 번데기 날개 샘플을 성공적으로 수행 완료 관련 세부 정보를 포함 하는 프로토콜을 제공에서 발견 되 절차입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.
적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.
절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.

프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 ...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

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