Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o apoio financeiro dado a este projecto, a Mariana Di Doménico pela sua assistência técnica com microscopia confocal; CSIC para José Leonardo Báez para correções seu manuscrito; para Luciano Correa por sua dedicação para a criação do vídeo; a Natalia Rosano por emprestar sua voz para o vídeo e o centro de estoque de drosófila de Bloomington para fornecer os estoques utilizados neste estudo. O Apa1 anticorpo monoclonal anti-Ptc desenvolvido por Isabel Guerrero foi obtido do banco do desenvolvimento de hibridoma estudos (DSHB) sob os auspícios dos FORMULADORES e mantido pelo departamento de ciências biológicas, da Universidade de Iowa, Iowa City, IA 52242.

Dia 1
1. coleta e cultivo de pupas.
<ol>
	<li>Remover 0 h após a formação do casulo (APF) ou pré-pupa usando um pincel molhado de frascos culturas e colocá-los em frascos novos quase completar o período de desenvolvimento (ver 2.1 e 2.2). 
	Nota: Uma população saudável de moscas deve ser mantida usando protocolos padrão de cultivo. Depois de três ou quatro dias em que os ovos são postos, os adultos podem ser removidos de frascos para permitir um desenvolvimento ...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

O método de dissecação descrito neste vídeo pode ser usado para preparar amostras de alta qualidade da drosófila asas pupal de diferentes estágios de desenvolvimento para muitos tipos de técnicas (por exemplo, imunofluorescência, síntese de cDNA para ensaios PCR, in vitro desenvolvimento de asa). Em termos deste método o cientista envolvidos usaram 24-30 h APF. No entanto, não deve haver nenhum obstáculo dentro as etapas essenciais na dissecação da pupa mais jovem ou mais velho. ...

Asas de drosófila são desenvolvidas a partir dos discos de imaginária de asa. O primordial destes discos de asa são colocadas de lado durante o desenvolvimento embrionário como pequenos grupos de 20-30 células imaginária que invaginate do epitélio embrionário. Quando a larva está crescendo para a terceira fase de instar, mitose ocorre nas células imaginária em horários específicos característicos, aumentando seus números (cerca de 50000 células) e formando a ala disco1,2,3, 4. Como as células proliferam, elas forme um epitélio tubular, resultando em uma espiral Self dobrável compacta. Durante a pupa, o epitélio de disco telescópios para fora a forma que as duas camadas de asa e as veias longitudinais começam como lacunas entre eles, que ocorre duas vezes durante a asa do desenvolvimento5,6.
O arranjo das veias sempre tem um padrão idêntico; a capacidade de facilmente identificar cada alteração no âmbito da formação de veias faz mutações extremamente visíveis (por exemplo, faltando ou extra veias, mudanças nas posições de veia, etc.). Curiosamente, as variações do fenótipo são geralmente as provas de mutações em componentes conhecidos ou novela de sinalização de caminhos que são relevantes para o desenvolvimento da asa. Um dos caminhos que desempenha um papel na determinação da posição e mantendo a veia e territórios intervein é o Hedgehog (Hh) via6,7,8.
Dada a importância da ala pupal como um sistema modelo, será importante obter amostras de boa qualidade para trabalhar com. No passado, os cientistas que publicaram protocolos para dissecar Drosophila asas não deram um guia adequado para obter amostras viáveis. Sem a orientação de um pesquisador se claramente não pode visualizar o processo. Essas abordagens alternativas de dissecação a pupa é dividida em dois, separando a asa do tecido circundante e repetidamente lavada para remover os detritos. Este tipo de abordagem pretende deixar a folha livre de contaminantes, mas devido a experiência anterior, o processo é mais lento e há uma maior chance de comprometer a estrutura do frágeis asas9.
O procedimento descrito aqui foi desenvolvido pela demanda para encontrar um método rápido e eficiente para obter amostras de asa pupal apropriadas detectar proteínas específicas ou transcrições usando protocolos de immunodetection ou polimerase ensaios de reação em cadeia (PCR). Para ilustrar isso, a expressão e a localização de Patched (Ptc ou o receptor canônico da via Hh) é detectado em amostras de asa pupal, fornecendo um protocolo que inclui detalhes relevantes para executar com êxito o completo procedimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Desenvolvimento de asa em Drosophila melanogaster é um modelo ideal para o estudo de morfogênese a nível do tecido. Estes apêndices desenvolvem a partir de um grupo de células chamado discos imaginária de asa formados durante o desenvolvimento embrionário. Na fase larval os discos imaginária crescem, aumentando seu número de células e formando estruturas epiteliais monolayered. Dentro da pasta pupal, os discos imaginária brote para fora e dobram em bilayers ao longo de uma linha que se torna a futura margem da asa. Durante este processo, as veias primodia longitudinal se originam células veia nas potenciais superfícies dorsais e ventrais da asa. Durante a fase de pupa as listras de veia células da superfície de comunicam para gerar tubos apertados; ao mesmo tempo, as Cruz-veias começam a sua formação.
Com a ajuda de marcadores moleculares apropriadas, é possível identificar os principais elementos que compõem a ala durante seu desenvolvimento. Por esta razão, a capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas nesta estrutura é fundamental para estudar a sua abundância e localização relacionadas com o processo de desenvolvimento da asa.
O procedimento descrito aqui centra-se na manipulação de asas pupal, fornecendo instruções detalhadas sobre como dissecar a ala durante a fase de pupa. A dissecção de tecidos pupal é mais difícil de executar do que suas contrapartes em larvas de terceiro instar. É por isso que esta abordagem foi desenvolvida, para obter amostras de rápida e eficiente de alta qualidade. Detalhes de como delgados e montagem destas amostras de asa, para permitir a visualização de proteínas ou componentes celulares, são fornecidas no protocolo. Com pouco conhecimento, é possível coletar 8-10 asas pupal de alta qualidade em um curto espaço de tempo.

O protocolo oferece um método simples para a obtenção de amostras de asa pupal que retêm a morfologia familiar da asa. Partir dessas preparações, é possível obter pilhas de imagens que podem ser projetadas como 2-D ou 3-d, para investigar a distribuição e/ou o enriquecimento das proteínas durante a diferenciação da ala. Um protocolo semelhante (veja a nota em 2.9) pode ser usado para coletar a amostra de grandes asas pupal (envolvendo asas pupal de 50-80) necessária para sin...

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A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

A capacidade de detectar com precisão as transcrições ou proteínas em Drosophila tecidos é fundamental para estudar a sua abundância e relacionadas com o processo de desenvolvimento de localização. Aqui está a descrição de um procedimento simples para dissecar as asas pupal. Estas asas podem ser usadas como amostras em várias técnicas (imuno-histoquímica, ensaio PCR, etc.).

Um método rápido e eficiente para dissecar asas Pupal de Drosophila apropriado para Immunodetections ou ensaios PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

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