Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить CSIC за финансовую поддержку этого проекта, Мариана Di Doménico для ее технической помощи конфокальной микроскопии; для Хосе Леонардо Баэс для исправления его рукопись; для Лусиано Корреа за его приверженность созданию видео; для Натальи Rosano для кредитования Блумингтон дрозофилы фондовой центр для обеспечения запасов, используемые в данном исследовании и ее голос для видео. Apa1 моноклонального анти Ptc разработала в Isabel Герреро был получен от развития банка гибридомной исследований (DSHB) под эгидой NICHD и поддерживается университета штата Айова, Отделение биологических наук, Айова-Сити, IA 52242.

1 день
1. сбор и культивирования куколок.
<ol>
	<li>Удалить 0 h после формирования puparium (АТФ) или prepupae, с помощью мокрой кистью из искусственного флаконов и поместить их в новые флаконы для почти полного периода развития (см. 2.1 и 2.2). 
	Примечание: Здорового населения мух ...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Метод вскрытия, описанные в этом видео может использоваться для подготовки образцов высокого качества дрозофилы куколки крыльев от развития различных этапов для многих типов методов (например, иммунофлюоресценции, синтез cDNA в анализы ПЦР, в пробирке крыло развития). С т?...

Дрозофилы крылья развиты из имагинальных дисков крыла. Изначального этих дисков крыла отложить в сторону во время эмбрионального развития как небольшие группы 20-30 имагинальных ячеек из эмбриональных эпителия инвагинировать. В то время как личинка растет на третий этап instar, митоз происходит в имагинальных клеток на конкретных характеристические времена, повышение его номера (около 50000 клетки) и формирования крыло диск1,2,3, 4. Как клетки размножаются, они модные трубчатых эпителия, что приводит к самостоятельной раскладной компактный спираль. В ходе Окукливание эпителий диска Телескопы в виде двухслойной крыло и продольные Вены начать как пробелы между ними, которое происходит дважды в течение крыло развития5,6.
Расположение вен всегда имеет идентичные шаблон; возможность легко определить все изменения в пределах вен образования делает мутации чрезвычайно видимым (например отсутствующие или лишние вен, изменения в духе позиции и т.д.). Интересно, что вариации фенотип обычно являются свидетельством мутаций в известных или Роман компонентов сигнальные пути, которые имеют отношение к развитию крыла. Одним из путей, которые играет определенную роль в определении положения и поддержания вен и intervein территорий является ежа (Hh) путь6,,78.
Учитывая важность куколки крыла как модель системы, это будет важно для получения хорошего качества образцов для работы с. В прошлом ученые, которые опубликованы протоколы для того чтобы рассечь дрозофилы крылья не дали соответствующее руководство для достижения реальных образцов. Без руководства исследователь один нельзя четко визуализировать процесс. В этих альтернативных подходов рассечения куколки разделен на два, отделяя крыло от окружающих тканей и многократно промывают для удаления мусора. Такого рода подход претензий оставить бесплатно крыло загрязняет, но из-за предыдущего опыта процесс медленнее и выше вероятность компрометации структуру хрупких крылья9.
Процедуру, описанную здесь был разработан спроса найти быстрый и эффективный метод для получения образцов куколки крыла, подходящих для выявления специфических белков или стенограммы, протоколы immunodetection или полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализов. Чтобы проиллюстрировать это, выражение и локализации заплата (Ptc или канонического рецептор Hh путь) обнаружен в образцах куколки крыла, обеспечивая протокол, который включает в себя соответствующие детали успешно провести полный процедура.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Крыло развитие в Drosophila melanogaster является идеальной моделью для изучения морфогенеза на тканевом уровне. Эти придатках развиваются из группы клеток, названный крыло имагинальных дисков, сформированные в ходе эмбрионального развития. В личиночной стадии имагинальных дисков растут, увеличивая его количество клеток и формирования однослойное эпителиальных структур. Внутри куколки дела имагинальных дисков бутон и сложите в бислоев вдоль линии, которая становится будущее края крыла. В ходе этого процесса продольной primodia вен возникают Вены клетки на перспективных дорсальной и вентральной поверхности крыла. На стадии куколки полосы вен клеток каждой поверхности общаться с целью создания жесткой трубы; в то же время кросс вен начать их формирования.
С помощью соответствующих молекулярных маркеров это возможно для определения основных элементов, составляющих крыла во время его разработки. По этой причине способность точно обнаруживать стенограммы или белков в этой структуре имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития крыла.
Процедура описана здесь сосредоточена на манипулирование куколки крылья, предоставляя подробные инструкции о том, как анализировать крыло на стадии куколки. Рассечение куколки ткани сложнее, чем их коллеги в третьего возраста личинок. Вот почему этот подход был разработан, чтобы получить быстрое и эффективное высокое качество образцов. Подробная информация о том, как имунноконтраст и горе эти образцы крыло, чтобы позволить визуализации белки или клеточных компонентов, предоставляются в протоколе. С небольшим опытом можно собрать 8-10 высокое качество куколки крылья в короткий промежуток времени.

Протокол предоставляет простой метод для получения образцов куколки крыла, которые сохраняют знакомые морфология крыла. Из этих препаратов можно получить стеки изображений, которые могут быть спроектированы как 2-D и 3-D, для изучения распределения и/или обогащения бел...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Способность точно обнаруживать стенограммы или белков в тканях дрозофилы имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития. Вот описание простой процедуры для того чтобы рассечь куколки крылья. Эти крылья могут использоваться в качестве образцов в несколько приемов (иммуногистохимии, ПЦР анализа и т.д.).

Быстрый и эффективный метод для того чтобы рассечь куколки крылья дрозофилы подходит для Immunodetections или анализы ПЦР

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Сотовый агрегации анализов для оценки привязки дрозофилы паз с транс-лигандов и его ингибирование СНГ-лигандами

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Рассечение дрозофилы куколки сетчатки для иммуногистохимии, Западный анализ и РНК изоляции

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...