Name: a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays
Uploaded: 2017-12-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

CSIC Mariana Di Doménico confocal mikroskobu ile onun teknik yardım almak için bu projeye verilen mali destek için teşekkür etmek istiyorum; onun el yazması düzeltmeler için José Leonardo Báez için; Luciano Correa video kurulması için yaptığı özveri için için; Rosano sesini video için ve bu çalışmada kullanılan hisse senetleri sağlamak için Bloomington Drosophila stok merkezi borç verme için Natalia için. Monoklonal anti-Ptc geliştirilen Apa1 Isabel Guerrero tarafından gelen gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB)'da NICHD elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından yapılmaktadır.

Gün 1
1. toplama ve kültür pupa.
<ol>
	<li>Puparium oluşumu (APF) veya ıslak fırça kültürlü şişeleri kullanarak prepupae sonra 0 h kaldırmak ve neredeyse Geliştirme süresini tamamlamak için yeni şişeleri koyun (bkz: 2,1 ve 2,2). 
	Not: Sinekler sağlıklı bir nüfusa standart kodlamayla protokolleri kullanarak sağlanmalıdır. Üç ya da dört gün sonra içinde yumurta koyulur yetişkin bireylerin en uygun bir gelişme izin vermek için şişeleri kald?...

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

Bu videoda açıklanan diseksiyon yöntem teknikleri birçok türleri için farklı geliştirme aşamalarını Drosophila pupa kanat örnekleri kaliteli hazırlamak için kullanılabilir (Örneğin, ayirt, cDNA sentezi için PCR deneyleri, Tüp Bebek kanat geliştirme). Bu yöntem açısından bilim adamı dahil 24-30 h APF kullandık. Ancak genç ya da yaşlı pupa diseksiyon temel adımları içinde hiçbir engel olmalıdır. Değişiklikler daha küçük sahne pupa karşılamak için yapıl...

Drosophila kanat kanat Imaginal disklerinden geliştirilir. Bu kanat diskler ilkel konur bir kenara embriyonik epitel invaginate 20-30 Imaginal hücre küçük gruplar olarak embriyonik gelişim sırasında. Larva üçüncü INSTAR Sahne Alanı'na büyüyor sırasında mitoz Imaginal hücrelerde, numaraları (yaklaşık 50000 hücreleri) yükselterek ve kanat oluşturan1,2,3disk belirli karakteristik zamanlarda oluşur, 4. Hücrelerin prolifere olarak, onlar kendi kendine katlanır bir kompakt spiral kaynaklanan bir borulu epitel moda. Pupation sırasında disk epitel dışarı formu iki katmanlı kanat teleskoplar ve boyuna damarlar lacunae aralarında, olarak iki kez kanat gelişimsel5,6sırasında oluştuğu başlar.
Damarlar düzenlenmesi her zaman özdeş bir deseni vardır; kolayca her değişiklik damar oluşumu içinde tanımlama yeteneği mutasyonlar son derece görünür (örneğin eksik veya fazla damarlar, değişiklikler ven pozisyonlar, vb.) yapar. İlginçtir, fenotip çeşitleri genellikle kanat geliştirme için uygun olan yollar sinyal, bilinen ya da roman bileşenleri mutasyonların kanıtı vardır. Bir konumu belirleme ve ven ve intervein bölgeleri korumak bir rol oynar yollar kirpi (Hh) yolu6,7,8' dir.
Pupa kanat önemi bir modeli sistem olarak göz önüne alındığında, çalışmak için kaliteli örneklerini almak önemli olacaktır. Geçmişte, protokolleri kopyalayabilmek Drosophila kanatlar için yayımlamış bilim adamları uygulanabilir örnekleri ulaşmak için uygun bir rehber vermedin. Bir araştırmacı rehberlik bir açıkça işlemi görselleştirmek olamaz. Bu alternatif diseksiyon yaklaşımlar pupa iki, ayıran kanat doku çevreleyen bölünmüş ve enkaz kaldırmak için tekrar tekrar yıkadım. Bu tür bir yaklaşım talep ücretsiz olarak kanat bırakmak kirlenmektedir ama önceki yılların deneyimi daha yavaş bir süreçtir ve kırılgan kanatları9yapısını ödün bir yüksek şans olduğunu.
Burada açıklanan yordamı pupa kanat örneklerini spesifik proteinlerin veya immunodetection iletişim kuralları veya Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) deneyleri kullanarak transkript algılamaya uygun almak için hızlı ve etkili bir yöntem bulmak için talep tarafından geliştirilmiştir. Bu, ifade ve yerelleştirme yamalı (Ptc veya Hh yolu kurallı reseptör) göstermek için başarıyla tam taşımak için ilgili ayrıntıları içeren bir protokolü sağlayan pupa kanat yapılan tespit yordam.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

Drosophila melanogaster kanat geliştirme morfogenez doku düzeyinde eğitim için ideal bir modeldir. Kanat Imaginal diskler embriyonik gelişim sırasında oluşan adlandırılmış hücreler bir grup bu ekleri geliştirmek. Larva aşamasında Imaginal diskler, onun hücre sayısı artan ve monolayered epitel yapıları oluşturan büyümek. Pupa çantasının içinde Imaginal diskler dışarı ahbap ve bilayers kanat gelecekteki marjı olur bir çizgi boyunca içine katlayın. Bu işlem sırasında boyuna primodia damar damar hücreleri kanat potansiyel dorsal ve ventral yüzeylerinde kaynaklanır. Pupa aşamasında damar hücreleri her yüzey çizgili sıkı tüpler oluşturmak için iletişim kurma; aynı zamanda, çapraz-damarlar onların oluşumu başlar.
Uygun moleküler işaretleyiciler yardımıyla, kanat gelişimi sırasında beste büyük öğeleri tanımlamak mümkündür. Bu nedenle, doğru bir şekilde transkript veya proteinler bu yapısında algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme kanat geliştirme süreciyle ilgili eğitim için önemlidir.
Yordamı pupa kanat kanat pupa aşamasında incelemek konusunda ayrıntılı yönergeler sağlama, manipüle üzerinde odaklanır burada açıklanan. Pupa doku diseksiyon üçüncü INSTAR larva meslektaşlarına gerçekleştirmek daha zordur. Bu yüzden bu yaklaşım hızlı ve verimli kaliteli örneklerini almak için geliştirilmiştir. Nasıl immunostain ve mount ayrıntılarını iletişim kuralında proteinler veya hücre bileşenleri, görselleştirme izin vermek için bu kanat örnekleri sağlanır. Küçük uzmanlığı ile 8-10 kaliteli pupa kanatları kısa bir miktarda toplamak mümkündür.

Protokol kanat tanıdık Morfoloji korumak pupa kanat örnekleri elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır. Bu hazırlıklar yığınlar olarak 2-B veya 3-b, dağıtım ve/veya proteinler zenginleştirme kanat farklılaşma sırasında araştırmak için öngörülen görüntüleri elde etmek mümkündür. Benzer bir Protokolü (2,9 nota bakın) büyük pupa kanat örnek (içeren 50-80 pupa kanatları) tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA), PCR reaksiyonları içinde kullanı...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...