Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

Vi anerkender Vienna Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila stock center (NIH P40OD018537) for at give Drosophila stammer. Vi er taknemmelige for Klämbt laboratoriet for at indføre os til øen analysen og Martijn Eidhof til opbygning af øen assay setup. Denne undersøgelse var i en del understøttes af E-sjælden-3 fælles tværnationale kalder give, "Forberede autosomal recessiv ataxias terapier" Forbered (NWO 9003037604), af en TOP tilskud (912-12-109) fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO), og af to DCN/Radboud University Medical Center ph.d.-stipendier. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Denne protokol beskriver makroen"Drosophila ø Assay", der kvantitativt vurderer Drosophila motor adfærd under øen assay. Makroen tæller præcist fluer på platformen over tid, hvilket gør øen assay meget følsomt og egnet til kvantitative høj overførselshastighed evaluering af bevægeapparatet defekter. Metoden giver mulighed for sammenligning af enhver tilstand med fluer dyrkes under forskellige genetiske og/eller miljømæssige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne udlæsning er således især nyttige som opdagelse værktøj, når du udfører store genetiske eller farmaceutiske skærme, når man studerer Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme, eller ved behandlingen af bevægelse eller fly adfærd.
Øen assay protokollen præsenteret i dette håndskrift giver fordele i forhold til eksisterende/alternative metoder. For eksempel, er video-tracking bevægelse langt mere tidskrævende og mindre egnet til at teste store stikprøvestørrelser. Øen assay er en høj overførselshastighed screeningsværktøj, og i denne forstand, kan sammenlignes med hurtige interaktive negative geotaxis (RING) assay16. Forskellen mellem to er, at øen assays giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af bevægeapparatet problemer; fluer manglende evne til at forlade platformen kan være forårsaget af defekter i flugt, hoppe, eller gå adfærd forårsaget af wing (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) mangler. På den anden side vurderer RING assay defekter i klatring/gående adfærd forårsaget af ben (muskel/neuronal) mangler. I tilfælde af brugere er interesseret i flere adfærdsmæssige udlæsninger, kombineres øen analysen også nemt med andre assays, såsom RING assay. Derudover lasere kræves til optogenetics kan nemt installeres i boksen ø assay, og opsætningen er så simpel, at det nemt kan flyttes til et værelse, hvor temperatur og lys kan reguleres.
For at sikre succes og reproducerbarhed af øen analysen beskrives her, bør flere henstillinger følges. Alikvot og overførsel fluer til den eksperimentelle test hætteglas på mindst én dag før forsøget at undgå virkningerne af CO2 eller kolde anæstesi. Må ikke overcrowd de eksperimentelle hætteglas (brug 10-15 fluer pr hætteglas, det er bedste for altid at placere det samme antal fluer pr hætteglas). Holde fluerne på frisk mad på alle tidspunkter. Hvis ikke endnu kender gennemfører analysen, praksis kaste flyver ind på platformen til at maksimere udbyttet. Også praksis hurtigt tilbagetrækningskraften hånden lige bagefter, da det forstyrrer dataanalyse (billedanalyse og flyve tælle start kun efter hånden er ude af billedet). Holde de miljømæssige og eksperimentelle betingelser identiske i eksperimenter, der skal sammenlignes (fx kontrol versus mutanter eller en genotype testet på forskellige alderstrin). Altid udføre eksperimenter på samme tid af dagen og vedligeholde hætteglas med kontrolleret temperatur og luftfugtighed vilkår. Statistisk power, test mindst tre tekniske replikater pr. biologiske replikeres.
For at sikre vellykket udførelsen af makroen beskrevet her, webcam og billede indstillinger skal ændres for at opnå maksimal kontrast: flyver vises som sorte objekter på en hvid platform. Når antallet af fluer ikke er korrekt optalt af makroen, justere indstillingerne kontrast, tjekke om ROI markeres korrekt og sikre, at størrelsen af fluer på platformen er ovenfor angivne minimum flyve størrelse indstilling (Se trin 8.3 i denne protokol). Indstillingerne skal kun defineres én gang. De er gældende for alle eksperimenter, så længe afstand mellem webcam og platformen ikke er ændret. Circularity_min og max indstillinger definerer cirkularitet af partikler (partikler = optalte fluer) der vil blive taget hensyn til analyse (flyver = optalte objekter). 1 repræsenterer en perfekt cirkel, og 0 repræsenterer en linje17. Da flyver altid til stede en vis grad af cirkularitet (en flue ikke kan vises som en lige linje), "Circularity_max"-indstilling er sat til 1 og indstillingen "Circularity_min" er indstillet på 0,4. Det er usandsynligt, at brugeren skal justere disse indstillinger.
Makroen gør lejlighedsvis tælle fejl, når en flue ligger tæt på grænsen til platformen. Dette kan forekomme, hvis fluerne ikke kan flyve men gang og ud af den brugerdefinerede ROI. I de fleste tilfælde kan vælge igen ROI (montering det så meget som muligt til platformen) nemt løse problemet. Men "Øen Assay analyse" scriptet er købedygtig opdager og korrekte forkert data tæller forårsaget af fluer gå ind og ud af ROI relativt godt. Selv om løsningen af webcam præsenteres her er høj nok til at diskriminere fluer i umiddelbar nærhed af temmelig godt, vi har gennemført yderligere algoritmer i billedet forædling af makroen"Drosophila ø Assay" som den vandskel og erodere funktion17. Disse lette den korrekte afgrænsning af fluer, der er i umiddelbar nærhed på platformen. Derudover makroen er ude af stand til at skelne mellem fluer, der sprang fra platformen eller fløj væk fra det. Ikke desto mindre, det generelt bemærkes, at sunde unge flyve stammer flyve væk straks når slippes på platformen, der henviser til, at ældre fluer og fluer med bevægeapparatet underskud forbliver længere på platformen og vil til sidst hoppe eller falde af platformen. På trods af disse begrænsninger giver analyse og analyse en meget nøjagtig måling af bevægeapparatet adfærd.
For at sikre vellykket udførelsen af scriptet "Øen Assay analyse", har brugeren til at sørge for at angive de korrekte stier for input og output filer i script rækker angivet i protokollen og til at levere data i den korrekte mappe format (som angivet i figur 2). Hvis brugeren finder de kriterier, der bruges til at bortfiltrere upålidelige forsøgsdata for strenge (række 68: den første værdi i kolonnen "Tæller" er mindre end eller lig med 5, og række 71: den første værdi i kolonnen "Tæller" er højere end det samlede antal fluer smidt på platfor RM + 3), slukke disse filterindstillinger ved at tilføje en # foran teksten i rækker 68 og 71 i scriptet "Øen Assay analyse". I dette tilfælde medtages alle datasæt i analysen. Alternativt, filterindstillinger kan ændres ved at justere værdierne i rækker, 68 og 71 efter brugernes behov. Muligt artefakter i Tæl værdier i "results.txt" genereret af makroen"Drosophila ø Assay" kan også justeres manuelt og køre scriptet igen på den justerede data. Når brugeren er interesseret i mere end 10 fps, eller mere end 10 s data, antallet af rammer, der behandles af scriptet "Øen Assay analyse" børjusteres. Den statistiske analyse kan også erstattes af brugerdefinerede alternativer.
En mappe kaldet "Eksempler på øen Assay," indeholdende eksempler med billede tidsserier fremstillet ved hjælp af øen assay, kan findes på følgende websted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download mappen "Eksempler på øen Assay" og følg de trin, der beskrives i denne protokol til hurtigt blive fortrolig med strukturen af fil opbevaring, forarbejdning af billederne med makroen "Drosophila ø analyse" og "Ø Assay analyse" script.
Øen assay, kan i kombination med den udviklede makro og analyse script, bruges til at evaluere og kvantificere den afvigende bevægelse opførsel af en Drosophila model af ataksi Telangiectasia. Eftersom analysen kan anvendes effektivt til forskellige aldre, er det velegnet til at analysere den potentielt progressive karakter af fænotyper.
I Resumé er ø-analysen i kombination med"Drosophila ø Assay" makro og scriptet "Øen Assay analyse" en omkostningseffektiv, pålidelig og yderst effektive assay til objektivt at analysere og kvantificere bevægeapparatet defekter af Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser i en høj overførselshastighed måde.

I de seneste år, fremskridt i næste generation sequencing teknologier har i høj grad bidraget til identifikation af gener underliggende degenerative bevægelsesforstyrrelser af hjernen (fx cerebellare ataksi og Parkinsons), af perifere neuronal oprindelse (fx, Amyotrofisk lateral sklerose og arvelig spastisk paraplegi), og af muskulære oprindelse (fx, Duchenne muskeldystrofi og født dystrofi)1,2,3,4 . På trods af dette, er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger bag de fleste af disse lidelser. En bedre forståelse af disse mekanismer er afgørende for at udvikle behandlingsformer.
Som mennesker, er bevægelse i modelorganismer, såsom fly og bevægelse i Drosophila, kontrolleret af central hjerne, perifere nervesystem og muskler. Derudover gør hurtig generationstid og genetiske værktøjskasse af Drosophila denne model organisme særligt velegnet til high throughput screening af gener involveret i bevægelsesforstyrrelser og for drug test5,6 . På grund af det betydelige antal betingelser, der skal afprøves i sådanne skærme, pålidelige, omkostningseffektive, og relativ simpel assays, samt værktøjer til at kvantificere outputresultater i en automatiseret måde, er særdeles ønskværdige.
Schmidt et al. (2012) 7 beskrevet en billig test kaldet "island assay" at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. Øen analysen har været anvendt med succes i storstilet screeninger til at identificere gener med glia-specifikke funktioner7, i evalueringen af Drosophila modeller af intellektuelle handicap8, og for den generelle evaluering af flyve motor adfærd9. Princippet om design af øen analysen består af en ophøjet platform, som flere fluer er kastet. Dette fremkalder en medfødte motoriske adfærd, der gør det sunde fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. Analysen måler antallet af fluer resterende på platformen over tid7,8,9. Alle disse funktioner viser, at øen analysen kan være en kraftfuld screeningsværktøj for gener involveret i bevægelsesforstyrrelser.
I øjeblikket, er kvantitativ analyse af filmet ø assay data udført manuelt7,8,9. For at forbedre effektiviteten af analysen, blev en low-cost-metoden udviklet til semi-automatisk kvantificere udslip af fluer fra platformen. Opsætningen bruger en simpel webcam tilsluttet en laptop til at indsamle billede tid serie af platformen, med rammer erhvervet hver 0,1 s. rammer behandles derefter med makroen"Drosophila ø Assay", der kvantificerer antallet af fluer på platformen over tid. Makroen"Drosophila ø Assay" er opdelt i tre uafhængige sub makroer: (I) "Opret stak og projektion," sub makro identificerer forskellige ø eksperimenter gemt i forskellige undermapper og skaber en stak og en projektion af hver tidsserier. (II) den "Definere Platform" sub makro åbnes fortløbende alle "Projection_image_name.tif" filer placeret i de enkelte eksperimentelle undermapper, hvorefter brugeren anmodes om at definere manuelt ø-perron som region af interesse (ROI). (III) "analyse" kvantificerer automatisk antallet af fluer resterende på platformen i løbet af tidsserien. Sub makroerne kan køres efter hinanden (i en køre) eller selvstændigt. For statistisk dataanalyse, blev et script udviklet til at automatisk behandle de fremkomne data og anvende en statistisk test for at afgøre, om behandlinger/genotyper opfører sig væsentligt forskellige fra hinanden (figur 1). Endelig er det påvist, at denne opsætning kan bruges til at evaluere og kvantificere afvigende bevægeapparatet evne til Drosophila model for ataksi telangiectasia (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Fremskridt i næste generation sequencing teknologier bidrager til identifikation af (kandidat) sygdomsgener for bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme med en øget hastighed. Dog er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse lidelser. Genetiske, molekylære og adfærdsmæssige værktøjskassen af Drosophila melanogaster gør denne model organisme især nyttigt at karakterisere nye sygdomsgener og mekanismer på en måde, høj overførselshastighed. Ikke desto mindre, høj overførselshastighed skærme kræver effektive og pålidelige assays, der ideelt set er omkostningseffektive og giver mulighed for automatiseret kvantificering af træk relevante for disse lidelser. Ø-analysen er en omkostningseffektiv og let set-up metode til at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. I denne analyse, er fluer kastet på en platform fra en fast højde. Dette fremkalder en medfødte motoriske svar, der muliggør fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. I øjeblikket, er kvantitative analyser af filmet ø assays udført manuelt, som er en omstændelig virksomhed, navnlig når du udfører store skærme.
Dette manuskript beskriver de"Drosophila ø analyse" og "Ø Assay analyse" algoritmer for høj overførselshastighed, edb og kvantificering af øen assay data. I opsætningen indsamler en simpel webcam tilsluttet en laptop en billed serie af platformen mens analysen udføres. "Drosophila ø Assay" algoritme udviklet til open source-software Fiji behandler disse billede serie og kvantificerer antallet af fluer på platform over tid for hver eksperimentelle betingelse. "Øen Assay analyse" script, kompatibel med den gratis software R, blev udviklet til automatisk behandle de fremkomne data og til at beregne, om behandlinger/genotyper er statistisk forskellig. Dette væsentligt forbedrer effektiviteten af øen analysen og gør det en kraftfuld udlæsning til grundlæggende bevægelse og flight adfærd. Det kan således anvendes til store skærme undersøger flyve bevægeapparatet evne, Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser, og medicin effektivitet.

I den beskrevne protokol, Drosophila ø assay data erhvervet og behandlet i tre trin. Første er flyvning undslippe svar af Drosophila smidt på ø-perron optaget med et webcam og gemt som individuelle .bmp-billeder (protokollen afsnit 1-7). For det andet behandler"Drosophila ø Assay" makro (trin 8) rammer, genererer en "result.txt" tekstfil (tabel 1), hvor antallet af objekter fundet i hver ramme er summeret, og en billedstak "Result_stack.tiff," som viser objekter fundet inden for platformen i hver ramme. Tredje, "Island Assay analyse" script (protokollen afsnit 9) behandler makro dataene i filerne "results.txt" af individuelle eksperimenter. Flere trin er indarbejdet i scriptet til at filtrere og kombinere data til statistiske analyser. Det første billede, hvor fluerne er kastet på platformen er opdaget og betragtes som tidspunkt 1. Tidligere rammer er elimineret fra datasættet. 100 frames efter tid punkt 1 (svarende til 10 s) er udvalgt til analyse. Eksperimenter som det oprindelige antal fluer blev fundet på platformen er mindre end 5 er automatisk udelukket fra analysen, at fjerne upålidelige resultater fra underdimensioneret eksperimenter. Eksperimenter som det oprindelige antal fluer blev fundet på platformen overstiger indstillingen "Antal fluer per vial" plus en tolerance på 3 er også udelukket. Dette eliminerer datasæt i hvilken støj partikler blev fejlagtigt registreret som fluer. Scriptet derefter beregnes procentdelen af fluer registreret for hvert tidspunkt, i forhold til det højeste antal fluer blev fundet i serien. Fejl i DataSet forårsaget af fluer gå ind og ud af ROI (påvises som et fald, efterfulgt af en stigning i procentdelen af fluer på platformen over tid) rettes automatisk af vedrørende dem som konsekvent nuværende på platformen på tidligere stadier . Alle Repliker datasæt for en specifik eksperimentel betingelse, der var til stede i de vigtigste bibliotek er kombineret og eksporteret til filen "data_all_conditions.csv". Dens kolonner repræsenterer de variabler, der er beskrevet i tabel 2. Scriptet eksporterer også en linjegraf for hver eksperimentelle betingelse, navngivet efter den mappe, der indeholder dataene. Denne graf viser procentdelen af fluer resterende på platformen over tid (flight undslippe svar) for den eksperimentelle replikater findes i mappen respektive ()figur 3A-B). Middelværdi, SD og SEM for hver eksperimentelle betingelse er beregnet og opsummeret i filen "Statistik summary.csv". En Linjegraf, kaldet "Escape_response_all_conditions.tiff" viser den gennemsnitlige flyvning flugt reaktion for op til 12 eksperimentelle betingelser er til stede i hovedmappen ()figur 3 c). Endelig arealet under kurven for alle forsøgsbetingelser, der findes i hovedmappen beregnes og opsummeret i filen "AUC.csv". Afhængigt af antallet betingelser til stede i de vigtigste mappe, scriptet vil enten udføre en to-sidede uparret Welch t-test (2 betingelser) eller en ANOVA med Tukey korrektion for flere test (mere end 2 betingelser) for at afgøre om den eksperimenterende betingelser, der afviger betydeligt fra hinanden. Disse resultater er sammenfattet i "Welch_t-test_results.txt" eller "AUC_anova_results.txt." Når du udfører ANOVA, eksporterer scriptet også et "AUC_anova.tiff" fil, der viser forskellen i gennemsnitlige AUC og konfidensintervaller 95% af de eksperimentelle betingelser, der sammenlignes. Værdierne af absolutte arealet under kurven for de eksperimentelle flergangsbestemmelser for alle forsøgsbetingelser vises som individuelle datapunkter med medianerne i "AUC.tiff" (figur 3D).
Ataksi Telangiectasia (AT) er en autosomal recessiv bevægelse lidelse karakteriseret ved tidlig debut af cerebellare ataksi på grund af mutationer i ataksi Telangiectasia muteret (ATM) gen14. Mutanter af Drosophila orthologue ATM, tefu, vise defekter i mobilitet og lang levetid15. For at evaluere makroen"Drosophila ø Assay", en Drosophila model i ATT blev testet i island assay, og data output af makroen blev sammenlignet med manuelle data tæller. Resultaterne viser, at allestedsnærværende tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) betydeligt reducerer disse fluer evne til at forlade den platform i forhold til deres genetiske baggrund kontrol (w-; Actin-Gal4/+) ()figur 4). Efter 1 s, 50% af kontrol fluer var undsluppet platform, i modsætning til den &#60; 1% af tefu- RNAi flyver. Vigtigere, at oplysninger indhentet med makroen trofast gengivet oplysninger indhentet ved manuel optælling, der angiver, at makroen er et pålideligt værktøj, der kan bruges til kvantificering af øen assay data og evaluering af bevægelse fejl ( Figur 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figur 1: Flowchart beskriver kravene, eksperimentel procedure og analyse af øen assay. (A) ø assay udstyr. (B) eksperimentelle setup for øens assay. (C) ø assay. (D) behandling af øen assay data med makroen"Drosophila ø Assay". Makroen"Drosophila ø Assay" er sammensat af 3 sub makroer: 1) gøre stak og projektion, 2) Definer platform, og 3) analyse. (E) forarbejdning og statistisk vurdering af data ved hjælp af scriptet "Øen Assay analyse". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figur 2: eksempler på forskellige justeringer kræves under protokollen. (A) den nødvendige mappestruktur i hvilken ø assay eksperimenter skal opbevares for databehandling og analyse. (B) når du justerer indstillingerne for video, fluer skal vises sort på hvid baggrund. (C) billedramme outputfilerda reddet af billede-optagelse software beskrevet i dette håndskrift. (D) gule skitse viser platform udvælgelse. Lagrede platform udvælgelsen i "ROI Manager" er fremhævet med blåt. (E) fluer er repræsenteret som hvide prikker under justeringen af "Minimum flyve størrelse indstilling." Resultatvinduet viser området af fluer i pixels. (F) eksempel på en enkelt optaget billedramme (til venstre) og den tilsvarende ramme i den resulterende billedstak, fremstillet med makroen"Drosophila ø Assay" (til højre). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figur 3: resultat billeder fremstillet efter databehandling med "Øen Assay analyse" script. (A) Line graf, der viser flyvning undslippe svar for hver kontrol eksperimentelle replikeres. (B) linje graf viser flyvning undslippe svar for hver tefu RNAi eksperimentelle replikeres. (C) gennemsnitlige flyvning undslippe svar for angivne forsøgsbetingelser; fejllinjer udgør SEM. (D) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og mutant betingelser. Eksperimentelle flergangsbestemmelser for begge tefu RNAi og kontrol betingelser vises som individuelle datapunkter (i sort) med medianerne (rød linje). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figur 4: Allestedsnærværende tefu knockdown fluer Vis en betydeligt nedsat evne til at forlade platformen. Data repræsenterer procentdelen af fluer på platformen over tid (s) til kontrol (w-; Actin-Gal4/+) og tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) flyver. (antal flergangsbestemmelser = 5; fejllinjer repræsenterer SEM). (A) rå data indhentet med makroen"Drosophila ø Assay". (B) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og tefu RNAi betingelser opnås med makroen"Drosophila ø Assay" (Welch parrede t-test, ** p &#60; 0,01). (C) rå data opnået ved manuelt tælle antallet af fluer findes på øen pr. sekund. (D) Dot parceller der repræsenterer arealet under kurven distribution for kontrol og Tefu RNAi betingelser opnås ved optælling af hånd (Welch parrede t-test, ** p &#60; 0,01). Fejllinjer udgør SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolonnenavnet</td>
			<td colspan="3">Beskrivelse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skive</td>
			<td colspan="3">Rammenavn.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grev</td>
			<td colspan="3">Antallet af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samlet areal</td>
			<td colspan="3">Samlet areal af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gennemsnitlige størrelse</td>
			<td colspan="3">Samlet areal af de objekter, der er opdaget i den indramme, divideret med antallet objekter inden for rammerne af platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Område</td>
			<td colspan="3">Procentdelen af området besat af objekter med hensyn til det samlede areal af platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Samlede omkredsen af objekter fundet i ramme inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyve størrelse</td>
			<td colspan="3">Mindst flyve størrelsesindstilling defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay" (i pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området ROI</td>
			<td colspan="3">Området af platform (ROI) defineres af brugeren under kørsel af makroen sub definere platform (i pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antallet af fluer</td>
			<td colspan="3">Antallet af fluer anvendes pr. eksperiment defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay".</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Parametre måles af makroen"Drosophila ø Assay". De parametre, der er beskrevet i denne tabel vises i filen "results.txt" efter køre makroen"Drosophila ø Assay".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolonnenavnet</td>
			<td colspan="3">Beskrivelse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skive</td>
			<td colspan="3">Stelnummer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grev</td>
			<td colspan="3">Antallet af fluer blev fundet i rammen, inden for rammerne af platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Samlet areal af fluer blev fundet i rammen, inden for rammerne af platform (ROI) i pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyve størrelse</td>
			<td colspan="3">Mindst flyve post indstilling defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay" (i pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området ROI</td>
			<td colspan="3">Området af platform (ROI, i pixels) defineres af brugeren, når køre makroen sub "definerer platform".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antallet af fluer</td>
			<td colspan="3">Antallet af fluer anvendes pr. eksperiment defineres af brugeren i den grafiske brugerflade af makroen"Drosophila ø Assay".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% flyver til stede på platformen i de respektive skive/ramme i forhold til det højeste antal fluer fundet på platformen under eksperimentet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tidspunkt</td>
			<td colspan="3">Tidspunkt 1 repræsenterer den første ramme skal analyseres og svarer til den ramme, hvor fluerne først vises på platformen. Der er ialt 100 frames pr. replikat analyseret (svarende til 10 s, når du bruger indstillingerne beskrevet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksperiment</td>
			<td colspan="3">Antal flergangsbestemmelser pr. betingelse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betingelse</td>
			<td colspan="3">Angiver navnet på den eksperimentelle tilstand (ifølge brugerdefinerede navnet på mappen, der indeholder dataene).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: Beskrivelse af variablerne, der opnås efter databehandling med "Øen Assay analyse" script. De parametre, der er beskrevet i denne tabel vises i filen "data_all_conditions.csv" ved databehandling med scriptet "Øen Assay analyse".

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Ø-analysen er en relativt ny, omkostningseffektive assay, der kan bruges til at evaluere grundlæggende bevægeapparatet funktionsmåden for Drosophila melanogaster. Dette manuskript beskriver algoritmer til automatisk databehandling og objektiv kvantificering af øen assay data, hvilket gør dette assay en følsom, høj overførselshastighed udlæsning til store genetiske eller farmakologiske skærme.

Høj overførselshastighed analyse af bevægeapparatet adfærd i Drosophila ø Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Fremgangsmåder til assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay til fourageringsadfærd i<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestemmelse af Spontan motorisk aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay til at undersøge æglæggende præferencer af Individuel<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En simpel måde at måle Ændringer i Reward-søger Behavior Brug<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kvantificering af Drosophila Grooming Adfærd

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...