Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

Wij erkennen de Vienna Drosophila Resource Center en het Bloomington Drosophila voorraad center (NIH P40OD018537) voor het verstrekken van Drosophila stammen. We zijn dankbaar naar het Klämbt-laboratorium voor het introduceren van ons aan de bepaling van het eiland en Martijn Eidhof voor het bouwen van de eiland assay setup. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de E-zeldzame-3 gemeenschappelijke transnationale oproep verlenen "Voorbereiding van therapieën op autosomaal recessieve Ataxieën" voorbereiden (NWO 9003037604), door een TOP subsidie (912-12-109) van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO), en door twee DCN/Radboud University Medical Center PhD-beurzen. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dit protocol beschrijft de"Drosophila eiland Assay" macro die kwantitatief Drosophila motor gedrag tijdens de bepaling van het eiland beoordeelt. De macro telt nauwkeurig de vliegen op het platform na verloop van tijd, waardoor het eiland assay zeer gevoelig en geschikt voor kwantitatieve evaluatie van de high-throughput van motorische defecten. De methodologie voorziet de vergelijking van enige voorwaarde, met vliegen gegroeid onder verschillende genetische en/of milieu-omstandigheden, met inbegrip van drug blootstelling. Deze uitlezing is dus vooral handig als ontdekkingshulpmiddel bij het uitvoeren van grote genetische of farmaceutische schermen, bij de studie van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten, of bij het onderzoek van motoriek of vlucht gedrag.
Het eiland assay protocol gepresenteerd in dit manuscript biedt voordelen ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden. Video-tracking motoriek is bijvoorbeeld veel meer tijd in beslag en minder geschikt voor het testen van grote steekproeven. De bepaling van het eiland is een high-throughput screening tool, en, in die zin is vergelijkbaar met de snelle interactieve negatieve geotaxis (RING) assay16. Het verschil tussen de twee is dat het eiland testen mogelijk maakt voor de detectie van een breder scala van motorische problemen; het onvermogen van vliegen om te vertrekken het platform kan worden veroorzaakt door gebreken in vlucht, springen, of wandelen gedrag veroorzaakt door vleugel (spier/neuronale) en/of been (spier/neuronale) gebreken. Aan de andere kant, beoordeelt de RING assay gebreken in beklimmen/wandelen gedrag veroorzaakt door gebreken van het been (spier/neuronale). In het geval dat gebruikers zijn geïnteresseerd in meerdere gedrags uitlezingen, kan de bepaling van het eiland ook gemakkelijk gecombineerd worden met andere testen, zoals de bepaling van de RING. Bovendien, lasers vereist voor optogenetics kunnen gemakkelijk geinstalleerd worden in het eiland assay vak, en de installatie is zo eenvoudig dat het gemakkelijk kan worden verplaatst naar een kamer waar temperatuur en licht kunnen worden gecontroleerd.
Om ervoor te zorgen het succes en de reproduceerbaarheid van de test van de eiland hier beschreven, moeten verscheidene aanbevelingen worden opgevolgd. Aliquot en overdracht de vliegen op de experimentele proef flesjes op ten minste één dag voor het experiment om de effecten van CO2 of koude anesthesie te voorkomen. Niet de experimentele flesjes doen overcrowd (gebruik 10-15 vliegen per flacon; het is het beste om altijd hetzelfde aantal vliegen per flacon). Houd de vliegen op vers voedsel te allen tijde. Als dit niet nog vertrouwd zijn met het uitvoeren van de bepaling, praktijk gooien vliegt op het platform te maximaliseren van het rendement. Ook de praktijk snel intrekken de hand vlak daarna, zoals het interfereert met de data-analyse (beeldanalyse en vlieg tellen start pas na de hand uit het beeld). Houden van de milieu- en experimentele voorwaarden identiek in experimenten die moeten worden vergeleken (bijvoorbeeld besturingselementen versus mutanten of een genotype getest op verschillende leeftijden). Altijd op hetzelfde moment van de dag uit te voeren van de experimenten en onderhouden van de flesjes onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Test voor statistisch onderscheidingsvermogen, ten minste drie technische replicatieonderzoeken per biologische repliceren.
Voor het succesvol vervullen van de macro beschreven hier, webcam en beeld instellingen moeten worden aangepast om te bereiken maximale contrast: vliegt verschijnen als zwarte objecten op een wit platform. Wanneer het aantal vliegen is niet goed geteld door de macro, aanpassen van de instellingen voor contrast, Controleer of de ROI goed is geselecteerd, en ervoor zorgen dat de grootte van het vliegen op het platform boven het opgegeven minimum vliegen grootte instellen (zie stap 8.3 van dit protocol). De instellingen moeten slechts één keer worden gedefinieerd. Zij gelden voor alle experimenten, zo lang als de afstand tussen de webcam en het platform is niet veranderd. De Circularity_min en max instellingen definiëren de cirkelvormigheid van de deeltjes (deeltjes = getelde vliegen) dat zal worden in aanmerking genomen voor de analyse (vliegt = getelde objecten). 1 staat een perfecte cirkel, en 0 voor een lijn17. Aangezien de vliegen leggen altijd een zekere mate van cirkelvormigheid (een vlieg kan niet worden weergegeven als een rechte lijn), de "Circularity_max" is ingesteld op 1 en de "Circularity_min" is ingesteld op 0.4. Het is onwaarschijnlijk dat de gebruiker moet deze instellingen aanpassen.
De macro maakt af en toe tellen fouten wanneer een vlieg dicht bij de grens van het platform ligt. Dit kan gebeuren als de vliegen niet maar lopen in en uit de door de gebruiker gedefinieerde ROI vliegen. In de meeste gevallen kan u de ROI (montage zo veel mogelijk op het platform) gemakkelijk oplossen zulks uitvaardiging. Echter, het "Eiland Assay Analysis" script is kundig voor speurder en juiste onjuiste gegevens graven veroorzaakt door vliegen lopen in en uit de ROI relatief goed. Hoewel de resolutie van de webcam die hier gepresenteerd hoog genoeg om te vliegen in de nabijheid vrij goed te discrimineren is, hebben wij aanvullende algoritmen in de veredeling van de afbeelding van de"Drosophila eiland Assay" macro, zoals de waterscheiding en eroderen functie17. Dit vergemakkelijkt de juiste afbakening van vliegen die dicht op het platform zijn. Bovendien de macro kan onderscheid maken tussen vliegen die sprong van het platform of vloog weg. Het is echter over het algemeen waargenomen dat gezonde jonge vliegen stammen vliegen weg zodra neergezet op het platform, terwijl oudere vliegen en vliegen met motorische tekorten langer op het platform blijven en zal uiteindelijk springen of vallen van het platform. Ondanks deze beperkingen bieden de bepaling en analyse een zeer nauwkeurige maatstaf van locomotor gedrag.
Om ervoor te zorgen de succesvolle uitvoering van het script "Eiland Assay Analysis", heeft de gebruiker om ervoor te zorgen om de juiste paden voor de input- en output-bestanden in de rijen van de script vermeld in het protocol en de gegevens te verstrekken in de juiste map-indeling (zoals aangegeven in Figuur 2). Als de gebruiker vindt de criteria gebruikt om te filteren op onbetrouwbare experimentele gegevens te streng (rij 68: de eerste waarde in de kolom "Count" is kleiner dan of gelijk aan 5; 71 rij: de eerste waarde in de kolom "Aantal" is hoger dan het totale aantal vliegen geworpen op de platfo RM + 3), zet deze filterinstellingen door toevoeging van een # vóór de tekst in de rijen 68 en 71 in het script van "Eiland Assay Analysis". In dit geval zal alle datasets in de analyse worden meegenomen. U kunt ook kunnen filterinstellingen worden gewijzigd door de waarden in de rijen 68 en 71 volgens de behoeften van de gebruikers aan te passen. Mogelijke artefacten in de waarden in de "results.txt" gegenereerd door de"Drosophila eiland Assay" macro tellen kunnen ook handmatig worden aangepast, en het script opnieuw kan worden uitgevoerd op de gecorrigeerde gegevens. Wanneer de gebruiker is geïnteresseerd in het verwerken van meer dan 10 fps, of meer dan 10 s van gegevens, het aantal frames dat door het "Eiland Assay Analysis" script verwerkt moetworden aangepast. De statistische analyse kan ook worden vervangen door gebruiker gedefinieerde alternatieven.
Een map met de naam "Voorbeelden eiland Assay," met voorbeelden met afbeelding-tijdreeksen verkregen met behulp van het eiland assay, kan worden gevonden op de volgende website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download de folder "Voorbeelden eiland Assay" en volg de stappen die worden beschreven in dit protocol te snel vertrouwd worden gemaakt met de structuur van de opslag van het dossier, de verwerking van de beelden met de macro "Drosophila eiland assay" en de "eiland Assay analyse" script.
Het eiland assay, kan in combinatie met de ontwikkelde macro en analyse script, worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van het gedrag van de abnormale beweging van een Drosophila model van ataxie Telangiectasia. Aangezien de bepaling kan efficiënt worden toegepast op verschillende leeftijden, is het zeer geschikt voor het analyseren van de mogelijk progressieve aard van fenotypen.
Kortom is het eiland assay, in combinatie met de macro"Drosophila eiland Assay" en het "Eiland Assay Analysis" script, een zeer efficiënte, kosteneffectieve en betrouwbare test voor objectief analyseren en kwantificeren van motorische defecten van Drosophila modellen van bewegingsstoornissen in zodanig hoge gegevensdoorvoer.

In de afgelopen jaren hebben vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijgedragen tot de identificatie van genen onderliggende degeneratieve bewegingsstoornissen van de hersenen (bijvoorbeeld cerebellaire ataxie en Parkinson), apparaat neuronale oorsprong (bijvoorbeeld Amyotrofische laterale sclerose en erfelijke spastische dwarslaesie), en gespierde oorsprong (bijvoorbeeld de spierdystrofie van Duchenne en de myotone dystrofie)1,2,3,4 . Ondanks dit, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het merendeel van deze aandoeningen. Een beter begrip van deze mechanismen is essentieel voor de ontwikkeling van therapieën.
Zoals mensen, in wordt beweging in modelorganismen, zoals vlucht en motoriek in Drosophila, beheerd door de centrale hersenen perifeer zenuwstelsel en de spieren. Bovendien, maken de snelle generatietijd en genetische toolbox van Drosophila dit model-organisme bijzonder geschikt voor de high-throughput screening van genen betrokken in bewegingsstoornissen en voor drugstests5,6 . Wegens het aanzienlijke aantal voorwaarden die worden getest in dergelijke schermen, betrouwbare, rendabele, en relatief eenvoudige tests, alsmede de instrumenten moeten te kwantificeren van de uitvoerresultaten op een geautomatiseerde manier, zijn zeer wenselijk.
Schmidt et al. (2012) 7 beschreven een low cost-test genoemd de "eiland assay" om te evalueren van Drosophila locomotor gedrag. De bepaling van het eiland is met succes in grootschalige screenings gebruikt om genen te identificeren met glia-specifieke functies7, bij de evaluatie van Drosophila modellen van verstandelijke beperking8, en voor de algemene evaluatie van motor probleem9vliegen. Het ontwerp van het principe van de bepaling van het eiland bestaat uit een verhoogde platform waarop verschillende vliegen zijn gegooid. Dit induceert een aangeboren motor gedrag waarmee gezonde vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. De test meet het aantal vliegen nog op het platform over tijd7,8,9. Al deze functies aangeven dat de bepaling van het eiland een krachtige screening tool voor genen betrokken bij bewegingsstoornissen kan zijn.
Op dit moment is de kwantitatieve analyse van gefilmd eiland assay gegevens handmatig7,8,9gedaan. Ter verbetering van de efficiëntie van de test, werd een goedkope methode ontwikkeld om semi-automatisch het kwantificeren van het ontsnappen van vliegt vanaf het platform. De setup een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop gebruikt voor het verzamelen van beeld destijds serie van het platform, met frames verworven elke 0,1 s. Frames worden vervolgens verwerkt met de macro"Drosophila eiland Assay" kwantificeert het aantal vliegen op het platform over tijd. De macro"Drosophila eiland Assay" is verdeeld in drie onafhankelijke sub macro's: (I) de "maken stack en projectie," sub macro identificeert verschillende eiland experimenten in verschillende submappen opgeslagen en creëert een stack en een projectie van elk tijdreeksen. (II) de "Definiëren Platform" sub macro verschijnt achtereenvolgens alle bestanden van de "Projection_image_name.tif" gelegen in de individuele experimentele submappen, op dat moment wordt de gebruiker gevraagd het eilandstation handmatig te definiëren als de regio van belang (ROI). (III) "analyse" kwantificeert automatisch het aantal vliegen tijdens de tijdreeksen op het platform blijven. De sub macro's kunnen worden uitgevoerd achter elkaar (in een punt) of onafhankelijk. Voor statistische gegevensanalyse ontstond een script voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en toe te passen van een statistische toets om te bepalen of behandelingen/genotypen beduidend verschillend van elkaar (Figuur 1 gedragen). Tot slot wordt aangetoond dat deze opstelling kan worden gebruikt voor het evalueren en kwantificeren van de afwijkende locomotor vermogen van een model van de Drosophila voor Ataxie-Teleangiëctasie (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie technologieën bijdragen tot de identificatie van de (kandidaat-) ziekte genen voor bewegingsstoornissen en andere neurologische ziekten met een toenemende snelheid. Echter, er is weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze aandoeningen. De genetische, moleculaire en behavioral werkset van Drosophila melanogaster maakt dit model-organisme bijzonder nuttig te karakteriseren van nieuwe genen van de ziekte en mechanismen in een high-throughput wijze. High-throughput schermen vereisen echter efficiënte en betrouwbare tests, die idealiter kosteneffectiever zijn en zorgen voor de geautomatiseerde kwantificering van eigenschappen relevant zijn voor deze aandoeningen. De bepaling van het eiland is een kosteneffectieve en gemakkelijk set-up method to evaluate methode Drosophila locomotor gedrag. In deze test, worden vliegen geworpen op een platform van een vaste hoogte. Dit induceert een aangeboren motor antwoord waarmee de vliegen om te ontsnappen aan het platform binnen seconden. Op dit moment zijn kwantitatieve analyses van gefilmd eiland tests handmatig gedaan, dat is een moeizame onderneming, met name bij het uitvoeren van grote schermen.
Dit manuscript wordt de"Drosophila eiland Assay" en "Eiland Assay Analysis" algoritmen voor hoge-doorvoer geautomatiseerde gegevensverwerking en kwantificering van eiland assay gegevens beschreven. In het configuratiemenu verzamelt een eenvoudige webcam aangesloten op een laptop een afbeelding-reeks van het platform, terwijl de bepaling wordt uitgevoerd. De"Drosophila eiland Assay" algoritme ontwikkeld voor de open-sourcesoftware Fiji verwerkt deze afbeelding serie en kwantificeert, experimentele voorwaarde, het aantal vliegen op het platform na verloop van tijd. Het "Eiland Assay Analysis" script, compatibel met de gratis software R, werd ontwikkeld voor het automatisch verwerken van de verkregen gegevens en om te berekenen of behandelingen/genotypen statistisch verschillend zijn. Dit aanzienlijk verbetert de efficiency van de bepaling van het eiland en maakt het een krachtige uitlezing voor fundamentele motoriek en vlucht gedrag. Het kan dus worden toegepast op grote schermen onderzoeken vliegen locomotor vermogen, Drosophila modellen van bewegingsstoornissen en werkzaamheid van het geneesmiddel.

In het protocol beschreven zijn Drosophila eiland assay gegevens verkregen en verwerkt in drie stappen. Eerst is de vluchtreactie ontsnappen van Drosophila gegooid op het eilandstation opgenomen met een webcam en opgeslagen als afzonderlijke BMP-afbeeldingen (protocol afdelingen 1-7). Ten tweede, de"Drosophila eiland Assay" macro (stap 8) verwerkt de frames, het genereren van een "result.txt" tekstbestand (tabel 1), waarin het aantal objecten aangetroffen in elk frame wordt samengevat, en een afbeeldingsstapel "Result_stack.tiff," waaruit blijkt de objecten binnen het gebied van het platform in elk frame wordt gedetecteerd. Ten derde, het "Eiland Assay Analysis" script (protocol sectie 9) verwerkt de macro gegevens opgeslagen in de bestanden "results.txt" van individuele experimenten. Verschillende stappen worden verwerkt in het script om te filteren en de gegevens voor statistische analyse combineren. Het eerste frame waarin de vliegen zijn geworpen op het platform is gedetecteerd en beschouwd als tijdstip 1. Eerdere frames worden geëlimineerd uit de dataset. 100 frames na tijd punt 1 (overeenkomt met 10 s) zijn geselecteerd voor analyse. Experimenten waarin het oorspronkelijke aantal vliegen aangetroffen op het platform kleiner dan 5 is worden automatisch uitgesloten van de analyse, het elimineren van onbetrouwbare resultaten van ondermaatse experimenten. Experimenten waarin het oorspronkelijke aantal vliegen aangetroffen op het platform groter is dan de instelling van de "Number of vliegen per flacon" plus een tolerantie van 3 zijn eveneens uitgesloten. Dit elimineert datasets in welke lawaai geconstateerd deeltjes ten onrechte als vliegen. Het script berekent vervolgens het percentage van vliegen gedetecteerd voor elk punt van de tijd in vergelijking met het hoogste aantal vliegen gedetecteerd in de serie. Fouten in datasets veroorzaakt door vliegen lopen in en uit de ROI (gedetecteerd als een daling gevolgd door een toename van het percentage van vliegen op het platform na verloop van tijd) worden automatisch gecorrigeerd door ten aanzien van hen als consequent aanwezig op het perron in eerdere stadia . Alle repliceren datasets voor een specifieke experimentele aandoening die aanwezig in de hoofdmap waren zijn gecombineerd en geëxporteerd naar het bestand "data_all_conditions.csv". De kolommen vertegenwoordigen de variabelen beschreven in tabel 2. Het script zal een lijndiagram experimentele voorwaarde, genoemd naar de map met de gegevens ook exporteren. Deze grafiek toont het percentage van vliegen op het platform blijven na verloop van tijd (escape vluchtreactie) voor de experimentele repliceert aanwezig zijn in de desbetreffende map ()figuur 3A-B). De gemiddelde, SD en SEM voor elke experimentele voorwaarde worden berekend en samengevat in het bestand "Statistieken summary.csv". Een lijndiagram genaamd "Escape_response_all_conditions.tiff" toont de gemiddelde vlucht vluchtreactie voor maximaal 12 experimentele voorwaarden aanwezig in de hoofdmap ()Figuur 3 c). Tot slot is het oppervlak onder de kromme voor alle proefomstandigheden die aanwezig zijn in de hoofdmap berekend en samengevat in het bestand "AUC.csv". Afhankelijk van het aantal voorwaarden aanwezig in de hoofdmap, het script zal ofwel het uitvoeren van een tweezijdige ongepaarde Welch t-test (2 voorwaarden) of een ANOVA met Tukey correctie voor meerdere testen (meer dan 2 voorwaarden) om te bepalen of de experimentele voorwaarden verschillen aanzienlijk van elkaar. Deze resultaten zijn samengevat in "Welch_t-test_results.txt" of "AUC_anova_results.txt." Bij het uitvoeren van de ANOVA, zal het script een "AUC_anova.tiff"-bestand waarin het verschil in de gemiddelde AUC en de 95%-betrouwbaarheidsintervallen van de experimentele omstandigheden die worden vergeleken ook exporteren. De waarden van de absolute oppervlak onder de kromme van de experimentele replicatieonderzoeken voor alle proefomstandigheden worden weergegeven als afzonderlijke gegevenspunten met medianen in "AUC.tiff" (figuur 3D).
Ataxie Teleangiëctasie (AT) is een autosomaal recessieve bewegingsstoornis gekenmerkt door vroege begin van de cerebellaire ataxie als gevolg van mutaties in het gen ataxie Telangiectasia gemuteerd (ATM)14. Mutanten van de Drosophila orthologue van ATM, tefu, weergeven defecten in mobiliteit en levensduur15 Om te evalueren van de macro"Drosophila eiland Assay", een Drosophila model van AT is getest in de bepaling van het eiland, en de uitvoer van de gegevens van de macro werd vergeleken met handmatige gegevens graven. Uit de resultaten blijkt dat alomtegenwoordige tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) aanzienlijk vermindert het vermogen van deze vliegen te vertrekken het platform ten opzichte van hun genetische achtergrond controles (w-; Actin-Gal4/+) (,Figuur 4). Na 1 s, 50% van de vliegen controle ontsnapt waren het platform, in tegenstelling tot de &#60; 1% van de tefu- RNAi vliegt. Nog belangrijker is, de gegevens die zijn verkregen met de macro trouw gereproduceerd de gegevens die zijn verkregen door handmatig tellen, die aangeeft dat de macro is een betrouwbaar hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor de kwantificering van eiland assay gegevens en de evaluatie van verkeer gebreken ( ) Figuur 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figuur 1: stroomdiagram waarin de vereisten, experimentele procedure en analyse van de eiland-assay. (A) eiland assay apparatuur. (B) experimentele opstelling voor de bepaling van het eiland. (C) eiland assay. (D) verwerking van eiland assay gegevens gekoppeld aan de macro"Drosophila eiland Assay". De"Drosophila eiland Assay" macro is samengesteld uit 3 sub macro's: 1) het maken van stapel en projectie, 2) definiëren platform, en 3) analyse. (E) verwerking en statistische evaluatie van gegevens met behulp van het script "Eiland Assay Analysis". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figuur 2: voorbeelden van verschillende aanpassingen die nodig zijn tijdens het protocol. (A) de vereiste directory-structuur in welke eiland assay experimenten moeten worden opgeslagen voor gegevensverwerking en -analyse. (B) bij het aanpassen van de video-instellingen, vliegen moeten verschijnen zwart op een witte achtergrond. (C) Image frame uitvoerbestandenzoals gered door de beeldopname software beschreven in dit manuscript. (D) de gele overzicht toont de platform-selectie. De selectie van de opgeslagen platform in de "ROI-Manager" is gemarkeerd in blauw. (E) vliegen zijn als witte stippen vertegenwoordigd tijdens de aanpassing van de "minimale vliegen grootte instellen." Het venster geeft het gebied van de vliegen in pixels. (F) voorbeeld van een enkele opgenomen beeld frame (aan de linkerkant) en het bijbehorende frame in de resulterende afbeelding stack, verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay" (aan de rechterkant). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figuur 3: resultaat beelden verkregen na verwerking van de gegevens met de "Eiland Assay Analysis" script. (A) lijn grafiek waarin de vluchtreactie ontsnappen voor elke controle experimentele repliceren. (B) lijn grafiek toont de vluchtreactie ontsnappen voor elke tefu RNAi experimentele repliceren. (C) gemiddelde ontsnappen vluchtreactie voor aangegeven experimentele omstandigheden; de foutbalken vertegenwoordigen de percelen van de SEM. (D) Dot het gebied onder de curve verdeling voor controle en mutant voorwaarden vertegenwoordigen. Experimentele replicatieonderzoeken voor beide tefu RNAi en de controlevoorwaarden worden weergegeven als afzonderlijke gegevenspunten (in zwart) met medianen (rode lijn). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figuur 4: Alomtegenwoordige tefu vechtpartij vliegen tonen een aanzienlijk verminderde capaciteit om te vertrekken het platform. De gegevens vertegenwoordigen het percentage van vliegen op het platform na verloop van tijd (s) voor controle (w-; Actin-Gal4/+) en tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) vliegt. (aantal replicatieonderzoeken = 5; de foutbalken vertegenwoordigen de SEM). (A) onbewerkte gegevens verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay". (B) Dot percelen die vertegenwoordigt het oppervlak onder de kromme-verdeling voor de controle en tefu RNAi omstandigheden verkregen met de macro"Drosophila eiland Assay" (Welch ongepaarde t-test, ** p &#60; 0,01). (C) onbewerkte gegevens verkregen door handmatig tellen het aantal vliegen die aanwezig zijn op het eiland per seconde. (D) Dot percelen die vertegenwoordigt het oppervlak onder de kromme verdeling voor controle en Tefu RNAi omstandigheden verkregen door het tellen van de hand (Welch ongepaarde t-test, ** p &#60; 0,01). De foutbalken vertegenwoordigen de SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolomnaam</td>
			<td colspan="3">Beschrijving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segment</td>
			<td colspan="3">De naam van het frame.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graaf</td>
			<td colspan="3">Het aantal objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale oppervlakte</td>
			<td colspan="3">Totale oppervlakte van de objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemiddelde grootte</td>
			<td colspan="3">Totale oppervlakte van de objecten aangetroffen in het frame gedeeld door het aantal objecten binnen de grenzen van het platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Gebied</td>
			<td colspan="3">Het percentage van ruimte bezet door de objecten ten opzichte van de totale oppervlakte van het platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Totale omtrek van de objecten aangetroffen in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. grootte vliegen</td>
			<td colspan="3">Het minimum vliegen grootte instelling die is gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" (in pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gebied ROI</td>
			<td colspan="3">Het gebied van het platform (ROI), gedefinieerd door de gebruiker tijdens de duur van de sub macro definiëren platform (in pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aantal vliegen</td>
			<td colspan="3">Het aantal vliegen per experiment gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" gebruikt.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Parameters gemeten door de macro"Drosophila eiland Assay". De parameters die worden beschreven in deze tabel wordt weergegeven in het bestand "results.txt" tijdens het uitvoeren van de macro"Drosophila eiland Assay".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolomnaam</td>
			<td colspan="3">Beschrijving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segment</td>
			<td colspan="3">Framenummer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graaf</td>
			<td colspan="3">Het aantal vliegen gedetecteerd in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Totale oppervlakte van het vliegen gedetecteerd in het frame binnen de grenzen van het platform (ROI) in pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. grootte vliegen</td>
			<td colspan="3">Het minimum vliegen grootte ingang instelling die is gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" (in pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gebied ROI</td>
			<td colspan="3">Het gebied van het platform (ROI, in pixels), gedefinieerd door de gebruiker wanneer de sub macro definieert"platform".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aantal vliegen</td>
			<td colspan="3">Het aantal vliegen per experiment gedefinieerd door de gebruiker in de grafische interface van de macro"Drosophila eiland Assay" gebruikt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% vliegt aanwezig op het perron in het respectieve segment/frame ten opzichte van het hoogste aantal vliegen aangetroffen op het platform tijdens experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">Tijdstip 1 vertegenwoordigt van het eerste frame worden geanalyseerd en komt overeen met het frame waar de vliegen voor het eerst op het platform verschijnen. Er zijn een totaal van 100 beelden per repliceren geanalyseerd (overeenkomt met 10 s, bij het gebruik van de beschreven instellingen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td colspan="3">Aantal replicatieonderzoeken per voorwaarde.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voorwaarde</td>
			<td colspan="3">Geeft de naam van de experimentele conditie (volgens de gebruiker gedefinieerde naam van de map met de gegevens).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: beschrijving van de variabelen verkregen na verwerking van de gegevens met de "Eiland Assay Analysis" script. De parameters die worden beschreven in deze tabel worden weergegeven in het bestand "data_all_conditions.csv" bij het verwerken van de gegevens met het script "Eiland Assay Analysis".

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

De bepaling van het eiland is een relatief nieuwe, rendabele test die kan worden gebruikt voor het evalueren van de fundamentele motorische gedrag van Drosophila melanogaster. Dit manuscript wordt beschreven algoritmen voor automatische gegevensverwerking en objectieve kwantificering van eiland assay gegevens, waardoor dit een gevoelige en high-throughput uitlezing voor grote genetische of farmacologische schermen assay.

High-throughput analyse van Locomotor gedrag in de Drosophila eiland Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Opnamen in de Insecten Drosophila melanogaster En Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Het bestuderen van de neurale basis van Adaptive locomotorisch gedrag bij insecten

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly test voor foerageergedrag in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to-eierleggende Voorkeuren van de individuele onderzoeken<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...