Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
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Nous reconnaissons que le centre de ressources de drosophile de Vienne et le centre de stock de Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) pour la fourniture de souches de drosophile . Nous sommes reconnaissants au laboratoire Klämbt pour nous introduire à l’analyse de l’île et Martijn Eidhof pour la construction de l’installation de dosage de l’île. Cette étude a été en partie pris en charge par l’appel E-RARE-3 Transnational commun accorder « Préparer des thérapies ataxies autosomiques récessives » PREPARE (NWO 9003037604), par une subvention supérieure (912-12-109) de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) et par deux bourses de DCN/Radboud University Medical Center PhD. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Ce protocole décrit la macro «Drosophile île Assay » qui évalue quantitativement Drosophila comportement moteur pendant le test de l’île. La macro compte avec exactitude les mouches sur la plateforme au fil du temps, rendant le dosage de l’île, très sensible et très approprié pour l’évaluation quantitative de haut débit de défauts locomotrices. La méthodologie permet la comparaison de n’importe quelle condition, avec mouches cultivées dans différentes conditions génétiques et/ou environnementale, y compris une exposition au médicament. Cette indication est donc particulièrement utile comme outil de découverte lors de l’exécution des grands écrans génétiques ou pharmaceutiques, lorsque l'on étudie des modèles de drosophile de dyskinésies et d’autres maladies neurologiques, ou lorsqu’on examine la locomotion ou vol comportement.
Le protocole d’essai de l’île présenté dans ce manuscrit présente des avantages par rapport aux méthodes existantes et parallèles. Par exemple, la locomotion de suivi vidéo est beaucoup plus longues et moins approprié pour les essais de vastes échantillons. Le dosage de l’île est un outil de criblage à haut débit et, en ce sens, est comparable au test rapide géotaxie négative interactive (anneau)16. La différence entre les deux est que les dosages de l’île permet la détection d’une vaste gamme de problèmes locomoteurs ; l’incapacité des mouches de quitter la plate-forme peut être causée par les défauts en vol, saut, ou marche de comportement causés par aile (muscle/neuronale) et/ou de la jambe (muscle/neuronale) défauts. En revanche, l’essai de l’anneau évalue les défauts de comportement escalade, marche, causés par des défauts de la cuisse (muscle/neuronale). Dans le cas où les utilisateurs sont intéressés par plusieurs lectures comportementales, le dosage de l’île aussi facilement combinable avec d’autres tests, tels que l’essai de l’anneau. En outre, les lasers nécessaires à optogenetics peuvent être facilement installés dans la zone de test de l’île, et la configuration est tellement simple qu’il peut facilement être déplacé dans une pièce où la température et la lumière peuvent être contrôlés.
Pour assurer le succès et la reproductibilité du dosage île décrite ici, plusieurs recommandations devraient être suivies. Aliquote et transfert les mouches à l’épreuve expérimentale flacons au moins un jour avant l’expérience pour éviter les effets du CO2 ou le froid anesthésie. Ne surchargez pas les flacons expérimentales (utilisation des mouches de 10-15 par flacon ; il est préférable de toujours placer le même nombre de mouches par flacon). Garder les mouches sur la nourriture fraîche à tout moment. Si ce n’est pas encore familier avec la tenue de l’essai, pratique jetant vole sur la plate-forme afin de maximiser le rendement. Pratiquent également de rétracter rapidement la main droite par la suite, car elle perturbe l’analyse des données (analyse d’images et mouche comptant démarrer qu’une fois la main hors de l’image). Garder les conditions expérimentales et environnementales identiques dans des expériences qui doivent être comparées (par exemple, des contrôles par rapport à des mutants ou un génotype testé à différents âges). Toujours effectuer les expériences à la fois de la journée et de maintenir les flacons sous température contrôlée et les conditions d’humidité. Pour la puissance statistique, tester au moins trois répétitions techniques par réplicat biologique.
Pour assurer l’exécution réussie de la macro décrite ici, paramètres de la webcam et l’image doivent être ajustées pour atteindre contraste maximal : vole apparaissant comme des objets noirs sur une plate-forme de blanche. Lorsque le nombre de mouches n’est pas correctement compté par la macro, ajuster les réglages de contraste, vérifier si le retour sur investissement est correctement sélectionné et faire en sorte que la taille des mouches sur la plate-forme est supérieur au minimum spécifié voler le reglage (voir étape 8.3 du présent protocole). Les paramètres doivent seulement être défini une fois. Elles sont applicables à toutes les expériences, tant que la distance entre la webcam et la plate-forme n’est pas modifiée. Les Circularity_min et les réglages max définissent la circularité des particules (particules = mouches comptés) qui va être pris en compte pour l’analyse (vole = objets comptés). 1 représente un cercle parfait, et 0 une ligne17. À moins que les mouches présentent toujours un certain degré de circularité (une mouche ne peut apparaître qu’une ligne droite), le « Circularity_max » est réglé à 1 et le paramètre « Circularity_min » est fixé à 0,4. Il est peu probable que l’utilisateur a besoin d’ajuster ces paramètres.
La macro fait parfois des erreurs de comptage quand une mouche se trouve à proximité de la frontière de la plate-forme. Cela peut se produire si les mouches ne peuvent pas voler à pied dans et hors le retour sur investissement défini par l’utilisateur. Dans la plupart des cas, resélectionnez le retour sur investissement (autant que possible à la plate-forme de montage) peut facilement résoudre ce problème. Toutefois, le script « Île test analyse » est capable de détecter et correcte de données incorrects comtes causée par le mouches marcher dans et hors le retour sur investissement relativement bien. Bien que la résolution de la webcam présentée ici est assez élevée pour discriminer les mouches à proximité assez bien, nous avons mis en place des algorithmes supplémentaires dans la procédure de traitement d’image de la macro «Drosophile île Assay », tels que la bassin versant et d’éroder la fonction17. Ces amendements facilitent la délimitation correcte des mouches qui se trouvent à proximité sur la plate-forme. En outre, la macro est incapable de distinguer entre les mouches qui a sauté de la plate-forme ou a volé loin de lui. Néanmoins, on observe généralement que des souches mouches jeunes en bonne santé s’envoler immédiatement lorsque déposé sur la plate-forme, tandis que les mouches plus âgés et les mouches avec déficits locomoteurs demeurer plus longtemps sur la plate-forme et finit par sauter ou tomber de la plate-forme. Malgré ces limites, le dosage et l’analyse fournissent une mesure très précise du comportement locomoteur.
Pour assurer une prestation réussie du script « Île test Analysis », l’utilisateur doit s’assurer d’entrer dans les chemins d’accès corrects pour les fichiers d’entrée et de sortie dans les lignes de script des dispositions figurant au protocole et à fournir les données dans le format de dossier approprié (comme il est indiqué dans la Figure 2). Si l’utilisateur constate les critères utilisés pour filtrer les données expérimentales fiables trop strictes (ligne 68 : la première valeur dans la colonne « Count » est inférieur ou égal à 5 ; ligne 71 : la première valeur dans la colonne « Nombre » est plus élevée que le nombre total de mouches jetés sur le platfo RM + 3), désactiver ces paramètres de filtrage en ajoutant un # devant le texte dans les lignes 68 et 71 dans le script « Île test Analysis ». Dans ce cas, tous les ensembles de données doivent figurer dans l’analyse. Alternativement, les réglages de filtre peuvent être changés en ajustant les valeurs des lignes 68 et 71 selon les besoins des utilisateurs. Artefacts possibles dans la valeur de comptage dans le « résultats.txt » généré par la macro «Drosophile île Assay » peuvent aussi être réglés manuellement, et le script peut être réexécutée sur les données ajustées. Lorsque l’utilisateur est intéressé par traitement de plus de 10 images par seconde, soit plus de 10 s de données, le nombre d’images traitées par le script « Île test Analysis » devraitêtre ajusté. L’analyse statistique peut également être remplacée par des équivalents définis par l’utilisateur.
Un dossier appelé « Exemples île Assay, » contenant des exemples avec temps-séries d’images obtenues à l’aide de l’essai de l’île, se trouvent à l’adresse Internet suivante : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Télécharger le dépliant « Exemples île Assay » et suivez les étapes décrites dans le présent protocole pour rapidement se familiariser avec la structure de stockage de fichiers, le traitement des images avec la macro « Dosage Drosophila Island » et le « analyse de test d’île » script.
Le dosage de l’île, en combinaison avec la macro développée et script analysis, peut être utilisé pour évaluer et quantifier le comportement aberrant de mouvement d’un modèle drosophile d’ataxie-télangiectasie. Étant donné que le dosage peut être efficacement appliqué à différents âges, il est bien adapté à l’analyse de la nature potentiellement progressive des phénotypes.
En résumé, le dosage de l’île, en combinaison avec la macro «Drosophile île Assay » et le script « Île test Analysis », est un dosage rentable, fiable et très efficace pour objectivement analyser et quantifier les défauts locomotrices de Drosophile modèles de dyskinésies de manière à haut débit.

Ces dernières années, les percées dans les technologies de séquençage de nouvelle génération ont grandement contribué à l’identification de gènes qui sous-tendent les dyskinésies dégénératives du cerveau (par exemple, une ataxie cérébelleuse et maladie de Parkinson), de périphériques neuronale origine (p. ex., la sclérose latérale amyotrophique et la paraplégie spastique héréditaire) et d’origine musculaire (par exemple, de dystrophie musculaire de Duchenne et la dystrophie myotonique)1,2,3,4 . Malgré cela, on connaît mal les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la plupart de ces troubles. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est essentielle à l’élaboration de thérapies.
Comme chez les humains, dans les organismes modèles, tels que le vol et de la locomotion chez la drosophile, est contrôlée par le cerveau central, système nerveux périphérique et les muscles. En outre, la durée d’une génération rapide et une boîte à outils génétique de la drosophile rendent cet organisme modèle particulièrement adapté pour le criblage à haut débit des gènes impliqués dans les troubles du mouvement et5,6 de dépistage des drogues . En raison du nombre important de conditions qui doivent être testés dans ces écrans, fiables et rentables et dosages simples relatives, comme outils pour quantifier les résultats de sortie de façon automatisée, sont fortement souhaitables.
Schmidt et al. (2012) 7 décrit un test peu coûteux, appelé le « test de l’île » pour évaluer le comportement locomoteur de drosophile . Le dosage de l’île a été utilisé avec succès aux examens préalables à grande échelle pour identifier les gènes avec des fonctions spécifiques aux cellules gliales7, dans l’évaluation de modèles de drosophile de déficience intellectuelle8et pour l’évaluation générale de voler le comportement moteur9. La conception du principe de l’essai de l’île se compose d’une plate-forme surélevée, sur laquelle plusieurs mouches sont levées. Ceci induit un comportement moteur inné qui permet aux mouches sains d’échapper à la plate-forme de quelques secondes. Le test mesure le nombre de mouches restant sur la plate-forme au fil du temps7,8,9. Toutes ces caractéristiques indiquent que l’île peut être un outil de dépistage puissant de gènes impliqués dans les troubles du mouvement.
Actuellement, l’analyse quantitative des données de test filmé de l’île se fait manuellement,7,8,9. Afin d’améliorer l’efficacité du test, il a développé une méthode de faible coût pour semi-automatiquement quantifier l’évasion de mouches de la plate-forme. Le programme d’installation utilise une simple webcam connectée à un ordinateur portable pour collecter les temps image série de la plate-forme, avec des cadres acquis chaque 0,1 s. images sont ensuite traitées avec la macro «Drosophile île Assay » qui quantifie le nombre de mouches sur la plate-forme au-dessus temps. La macro «Drosophile île Assay » est divisée en trois macros sous indépendants : (I) la « pile de créer et de la projection, » Sub macro identifie des expériences différentes îles stockés dans différents sous-dossiers et crée une pile et une projection de chacun séries temporelles. (II) la macro sous « Définir la plateforme » ouvrira successivement tous les fichiers « Projection_image_name.tif » situés dans les différents sous-dossiers expérimentales, moment auquel l’utilisateur est invité à définir manuellement la plate-forme de l’île dans la région d’intérêt (ROI). (III) « analyse » quantifie automatiquement le nombre de mouches restant sur la plate-forme au cours de la série chronologique. Les macros sous peuvent s’exécuter consécutivement (en un seul passage) ou de façon indépendante. Pour l’analyse de données statistiques, un script a été développé pour traiter automatiquement les données obtenues et d’appliquer un test statistique pour déterminer si les traitements/génotypes se comportent sensiblement différents les uns des autres (Figure 1). Enfin, il est démontré que cette configuration permet d’évaluer et de quantifier la capacité locomotrice aberrante d’un modèle drosophile ataxie télangiectasie (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Percées dans les technologies de séquençage de prochaine génération contribuent à l’identification des gènes de maladies (candidat) pour les troubles du mouvement et d’autres maladies neurologiques à une vitesse croissante. Cependant, on connaît les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces troubles. La boîte à outils génétique, moléculaire et comportementale de Drosophila melanogaster rend cet organisme modèle particulièrement utile pour caractériser des gènes de maladies nouvelles et mécanismes d’une manière de haut débit. Néanmoins, écrans de haut débit nécessitent des tests efficaces et fiables qui, idéalement, sont rentables et permettent la quantification automatisée des traits pertinents à ces troubles. Le dosage de l’île est un rentable et facilement mise en place méthode pour évaluer le comportement locomoteur Drosophila . Dans ce test, les mouches sont jetées sur une plate-forme d’une hauteur fixe. Ceci induit une réponse motrice innée qui permet les mouches d’échapper à la plate-forme de quelques secondes. À l’heure actuelle, des analyses quantitatives des essais filmés de l’île sont effectuées manuellement, qui est une entreprise laborieuse, notamment lors de l’exécution de grands écrans.
Ce manuscrit décrit les algorithmes «Drosophile île Assay » et « Île test Analysis » pour le haut débit, traitement automatisé des données et la quantification des données de test de l’île. Dans la configuration, une simple webcam connectée à un ordinateur portable recueille une série d’image de la plate-forme alors que l’analyse est réalisée. L’algorithme «Drosophile île Assay » mis au point pour le logiciel libre Fidji traite ces séries d’images et quantifie, pour chaque condition expérimentale, le nombre de mouches sur la plateforme au fil du temps. Le script « Île test Analysis », compatible avec le logiciel gratuit R, a été développé pour traiter automatiquement les données obtenues et pour calculer si les traitements/génotypes sont statistiquement différentes. Grandement, cela améliore l’efficacité du test de l’île et rend une lecture puissante base locomotion et comportement de vol. Il peut donc être appliqué aux grands écrans enquête mouche capacité locomotrice, Drosophila modèles des troubles du mouvement et l’efficacité du médicament.

Dans le protocole décrit, Drosophila île dosage sont acquises et traitées en trois étapes. Tout d’abord, la réaction de fuite de vol de Drosophila jetées sur le quai est enregistrée avec une webcam et stockée sous forme d’images .bmp individuels (sections 1 à 7 du protocole). Deuxièmement, la macro «Drosophile île Assay » (étape 8) traite les images, générer un fichier de texte « result.txt » (tableau 1), dans lequel le nombre d’objets détectés dans chaque trame est résumé et une pile d’image « Result_stack.tiff », qui montre les objets détectés dans la zone de la plate-forme dans chaque image. Troisièmement, le script « Île test Analysis » (protocole section 9) traite les données de la macro stockées dans les fichiers « résultats.txt » des expériences individuelles. Plusieurs étapes sont incorporés dans le script pour filtrer et combiner les données pour l’analyse statistique. La première image dans laquelle les mouches sont jetés sur la plate-forme est détectée et considérée comme point de temps 1. Les cadres antérieurs sont éliminés dans le dataset. 100 images suivent point 1 (correspondant à 10 s) sont sélectionnés pour l’analyse. Expériences dans lesquelles le nombre initial de mouches détectée sur la plate-forme est plus petit que 5 sont automatiquement exclus de l’analyse, en éliminant les résultats peu fiables des expériences de faible puissance. Expériences dans lesquelles le nombre initial de mouches détectée sur la plate-forme dépasse le paramètre « Nombre de mouches par flacon » plus une tolérance de 3 sont également exclus. Cela évite d’ensembles de données dans laquelle le bruit les particules ont été détectés par erreur d’oiseau. Le script puis calcule le pourcentage de mouches détectés pour chaque point dans le temps par rapport au plus grand nombre de mouches détectées dans la série. Erreurs dans datasets causée par les mouches marcher dans et hors le retour sur investissement (détecté comme une diminution suivie d’une augmentation du pourcentage de mouches sur la plateforme au fil du temps) sont automatiquement corrigées par les considérant comme toujours présents sur la plate-forme à des stades antérieurs . Tous les datasets répétées pour une certaine condition expérimentale qui n’existaient pas dans le répertoire principal sont combinés et exportés vers le fichier « data_all_conditions.csv ». Ses colonnes représentent les variables décrites dans le tableau 2. Le script sera également exporter un graphique linéaire pour chaque condition expérimentale, nommé d’après le dossier qui contient les données. Ce graphique montre le pourcentage de mouches restant sur la plate-forme au fil du temps (réaction de fuite de vol) pour l’expérimental réplique présent dans le dossier respectif ()Figure 3 a-B). La moyenne, SD et SEM pour chaque condition expérimentale sont calculés et résumées dans le fichier « Summary.csv statistiques ». Un ligne graphique appelé « Escape_response_all_conditions.tiff » montre la réaction de fuite de vol moyen pour jusqu'à 12 expérimentale des conditions présentent dans le dossier principalFigure 3) (). Enfin, l’aire sous la courbe pour toutes les conditions expérimentales présentes dans le dossier principal est calculé et résumée dans le fichier « AUC.csv ». Selon le nombre des conditions présentes dans le dossier principal, le script se soit produira un non apparié Welch t-test bilatéral (2 conditions) ou une analyse de la variance avec correction de Tukey pour plusieurs essais (plus de 2) déterminer si l’expérimental conditions diffèrent sensiblement les uns des autres. Ces résultats sont résumés dans « Welch_t-test_results.txt » ou « AUC_anova_results.txt. » Lorsque vous effectuez l’analyse de la variance, le script sera également exporter un fichier « AUC_anova.tiff » qui affiche la différence de l’ASC moyenne et les intervalles de confiance de 95 % des conditions expérimentales qui sont comparées. Les valeurs de l’absolu aire sous la courbe des répliques expérimentales pour toutes les conditions expérimentales sont affichés comme des points de données individuels avec médianes dans « AUC.tiff » (Figure 3D).
L’ataxie télangiectasie (AT) est une maladie autosomique récessive mouvement caractérisée par l’apparition précoce de l’ataxie cérébelleuse due à des mutations dans le gène de Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM)14. Mutants de l’orthologue de la drosophile de l' ATM, TFUE, affichent les défauts en mobilité et longévité15. Evaluer la macro «Drosophile île Assay », un modèle drosophile d’AT a été testé dans le dosage de l’île, et la sortie des données de la macro a été comparée à comptes manuelle des données. Les résultats montrent que omniprésent tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) diminue de manière significative la capacité de ces mouches à quitter la plate-forme par rapport à leurs contrôles de fond génétique (w-; Actin-Gal4/+) ()Figure 4). Après 1 s, 50 % des mouches contrôle avait échappé à la plate-forme, à la différence de la &#60; 1 % de tefuRNAi - mouches. Ce qui est important, les données obtenues avec la macro fidèlement reproduit les données obtenues par Manuel comptage, ce qui indique que la macro est un outil fiable qui peut être utilisé pour la quantification des données de test de l’île et l’évaluation des défauts de mouvement ( ) Figure 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figure 1 : organigramme décrivant les exigences, procédure expérimentale et analyse du dosage île. Équipement de dosage (A) l’île. (B) le montage expérimental pour l’analyse de l’île. (C) île de dosage. (D) traitement des données de test de l’île avec la macro «Drosophile île Assay ». La macro «Drosophile île Assay » est composée de 3 sous macros : 1) pile et projection, 2) définir la plateforme et analyse 3). (E) traitement et analyse statistique des données en utilisant le script « Île test Analysis ». <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figure 2 : exemples de différents ajustements requis au cours du protocole. Structure de répertoires (A) requis dans quelle île des expériences de dosage doivent être stockés pour traitement des données et l’analyse. (B) lorsque vous ajustez les paramètres vidéo, mouches doivent figurer noir sur fond blanc. (C) fichiers de sortie de cadre d’Imagecomme enregistré par le logiciel d’enregistrement d’images décrit dans ce manuscrit. (D), le jaune contour affiche la sélection de la plate-forme. La sélection de plate-forme stockées dans le gestionnaire de « ROI » est surlignée en bleu. Mouches (E) sont représentés comme des points blancs lors de l’adaptation de la « configuration de taille minimale de mouche ». La fenêtre des résultats indique la zone des mouches en pixels. (F) exemple d’une trame unique image enregistrée (à gauche) et le cadre correspondant à la pile de l’image résultante, obtenu avec la macro «Drosophile île Assay » (à droite). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figure 3 : images du résultat obtient après traitement des données avec le script « Île test analyse » (A) ligne graphique montrant la réaction de fuite de vol pour chaque contrôle expérimental répliquer. (B) ligne graphique montrant la réaction de fuite de vol pour chaque répétition expérimentale de RNAi TFUE. Réaction de fuite de vol moyen (C) pour des conditions expérimentales indiquées ; les barres d’erreur représentent les parcelles Dot SEM. (D) qui représente la surface sous la distribution de la courbe pour le contrôle et les conditions de mutant. Répliques expérimentales pour les deux conditions de RNAi et contrôle tefu apparaissent comme des points de données individuels (en noir) avec des médianes (ligne rouge). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figure 4 : Omniprésent tefu knockdown mouches montrent une capacité une baisse significative de quitter la plate-forme. Les données représentent le pourcentage de mouches sur la plateforme au fil du temps (s) pour le contrôle (w-; Actin-Gal4/+) et tefu Arni (w-; Actin-Gal4/GD11950) vole. (nombre de répétitions = 5 ; les barres d’erreur représentent la SEM). (A) les données brutes obtenues avec la macro «Drosophile île Assay ». (B) Dot parcelles représentant la surface sous la courbe de distribution pour contrôle et tefu Arni conditions obtenues avec la macro «Drosophile île Assay » (Welch non appariés t-test, ** p &#60; 0,01). (C) les données brutes obtenues en comptant manuellement le nombre de mouches présentes sur l’île par seconde. (D) Dot parcelles représentant la surface sous la distribution de la courbe pour Tefu RNAi conditions obtenues par comptage à la main et de contrôle (Welch non appariés t-test, ** p &#60; 0,01). Les barres d’erreur représentent le SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nom de colonne</td>
			<td colspan="3">Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranche</td>
			<td colspan="3">Nom de l’image.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comte</td>
			<td colspan="3">Le nombre d’objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superficie totale</td>
			<td colspan="3">Superficie totale des objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taille moyenne</td>
			<td colspan="3">Superficie totale des objets détectés dans le cadre divisé par le nombre d’objets dans les limites de la plate-forme (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Secteur</td>
			<td colspan="3">Le pourcentage de la superficie occupée par les objets à l’égard de la superficie totale de la plate-forme (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Périmètre total des objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouche taille min.</td>
			<td colspan="3">Le minimum fly réglage de taille définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay » (en pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone de retour sur investissement</td>
			<td colspan="3">La zone de la plate-forme (ROI) définie par l’utilisateur pendant l’exécution de la macro sous définir la plate-forme (en pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nombre de mouches</td>
			<td colspan="3">Le nombre de mouches utilisées par expérience définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay ».</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Paramètres mesurés par la macro «Drosophile île Assay ». Les paramètres décrits dans cette table apparaîtra dans le fichier « résultats.txt » lors de l’exécution de la macro «Drosophile île Assay ».
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nom de colonne</td>
			<td colspan="3">Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranche</td>
			<td colspan="3">Numéro de la trame.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comte</td>
			<td colspan="3">Le nombre de mouches détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Superficie totale des mouches détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouche taille min.</td>
			<td colspan="3">Le minimum voler le paramètre d’entrée de taille définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay » (en pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zone de retour sur investissement</td>
			<td colspan="3">La zone de la plate-forme (ROI, en pixels) définie par l’utilisateur lors de l’exécution de la macro sous « définir la plate-forme ».</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nombre de mouches</td>
			<td colspan="3">Le nombre de mouches utilisées par expérience définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay ».</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% les mouches présents sur la plate-forme de la tranche/le cadre respectif par rapport au nombre plus élevé de mouches détectée sur la plate-forme au cours de l’expérience.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validant</td>
			<td colspan="3">Point dans le temps 1 représente la première image à analyser et correspond au frame où les mouches apparaissent d’abord sur la plate-forme. Il y a un total de 100 images par réplicat analysés (correspondant à 10 s, lorsque vous utilisez les paramètres décrits.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td colspan="3">Nombre de répétitions par État.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condition</td>
			<td colspan="3">Indique le nom de la condition expérimentale (selon le nom du dossier contenant les données définies par l’utilisateur).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Description des variables obtenues après traitement des données avec le script « Île test analyse » Les paramètres décrits dans le présent tableau apparaissent dans le fichier « data_all_conditions.csv » sur le traitement des données avec le script « Île test Analysis ».

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High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Le dosage de l’île est un dosage relativement nouvel et rentable qui peut être utilisé pour évaluer le comportement locomoteur base de Drosophila melanogaster. Ce manuscrit décrit des algorithmes pour le traitement automatique des données et une quantification objective des données de test de l’île, ce qui en fait une lecture sensible et à haut débit pour les grands écrans génétiques ou pharmacologiques de dosage.

Analyse de haut-débit du comportement locomoteur dans le dosage de l’île de drosophile

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