Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
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Riconosciamo la drosofila Resource Center di Vienna e il centro stock Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) per la fornitura di ceppi di Drosophila . Siamo grati al laboratorio Klämbt per introdurre noi per il dosaggio di isola e Martijn Eidhof per la costruzione l'installazione di dosaggio di isola. Questo studio è stato in parte sostenuto dal E-RARE-3 Call transnazionale comune concedere "Preparazione di terapie per le atassie autosomiche recessive" PREPARE (NWO 9003037604), da una sovvenzione superiore (912-12-109) l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) e di due borse di studio dottorato DCN/Radboud University Medical Center. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Questo protocollo descrive la macro"Drosophila isola Assay" che valuta quantitativamente il comportamento motorio Drosophila durante il dosaggio di isola. La macro conta con precisione le mosche sulla piattaforma nel corso del tempo, rendendo il dosaggio di isola altamente sensibile e adatto per la valutazione quantitativa di alto-rendimento dei difetti dell'apparato locomotore. La metodologia consente il confronto di qualsiasi condizione, con mosche cresciuti sotto differenti condizioni ambientali e/o genetiche, compreso esposizione al farmaco. Questa indicazione è dunque particolarmente utile come strumento di scoperta durante l'esecuzione di grandi schermi genetici o farmaceutici, quando studiare modelli di Drosophila dei disturbi del movimento e altre malattie neurologiche, o esaminando la locomozione o volo comportamento.
Il protocollo di dosaggio isola presentato in questo manoscritto fornisce vantaggi rispetto ai metodi esistenti/alternativa. Ad esempio, il video-monitoraggio locomozione è richiede molto più tempo e meno adatto per testare campioni di grandi dimensioni. Il dosaggio di isola è uno strumento di screening ad alta resa e, in questo senso, è paragonabile al dosaggio rapido interattiva geotassi negativa (anello)16. La differenza tra i due è che i saggi di isola consente il rilevamento di una più vasta gamma di problemi dell'apparato locomotore; l'incapacità di mosche di lasciare la piattaforma può essere causato da difetti in volo, salto, o camminare comportamento causato da ala (muscolo/neuronali) e/o gamba (muscolo/neuronali) difetti. D'altra parte, l'analisi dell'anello valuta difetti nel comportamento di arrampicata/a piedi causate da difetti della gamba (muscolo/neuronali). Nel caso in cui gli utenti sono interessati a più letture del comportamento, il dosaggio di isola è anche perfettamente combinabile con altri dosaggi, ad esempio, il saggio di anello. Inoltre, laser necessario per optogenetica possono essere facilmente installati nella finestra di analisi isola, e l'installazione è così semplice che può essere facilmente spostato in una camera dove la temperatura e la luce può essere controllate.
Per garantire il successo e la riproducibilità del dosaggio isola descritto qui, una serie di raccomandazioni devono essere seguite. Aliquotare e trasferimento le mosche alla prova sperimentale fiale presso almeno un giorno prima dell'esperimento per evitare gli effetti dell'anestesia di CO2 o freddo. Non sovraffollamento le fiale sperimentale (uso 10-15 mosche per flaconcino; si consiglia di inserire sempre lo stesso numero di mosche per flaconcino). Tenere le mosche sul cibo fresco in ogni momento. Se non ancora familiarità con lo svolgimento di test, pratica gettando vola sulla piattaforma per massimizzare il rendimento. Anche la pratica rapidamente ritraendo la mano subito dopo, poiché interferisce con l'analisi dei dati (analisi dell'immagine e Vola conteggio inizio solo dopo che la mano è fuori dal quadro). Mantenere le condizioni ambientali e sperimentali identiche in esperimenti che devono essere confrontati (ad es., controlli contro mutanti o un genotipo testato alle età differenti). Sempre eseguire gli esperimenti allo stesso tempo del giorno e mantenere i flaconcini in condizioni di umidità e temperatura controllata. Per potere statistico, test tecnici almeno tre repliche per replica biologico.
Per garantire il buon funzionamento della macro descritto qui, impostazioni webcam e l'immagine devono essere regolate per ottenere il massimo contrasto: mosche che appaiono come oggetti neri su una piattaforma di bianco. Quando il numero di mosche non è conteggiato correttamente dalla macro, regolare le impostazioni di contrasto, controllare se il ROI è selezionato correttamente e assicurarsi che la dimensione delle mosche sulla piattaforma è superiore al valore minimo specificato volare impostazione dimensione (Vedi punto 8.3 del presente protocollo). Le impostazioni devono solo essere definito una sola volta. Sono applicabili a tutti gli esperimenti, come la distanza tra le webcam e la piattaforma non è cambiata. I Circularity_min e le impostazioni max definiscono la circolarità delle particelle (particelle = contati mosche) che si terrà in considerazione per l'analisi (mosche = oggetti contati). 1 rappresenta un cerchio perfetto e 0 rappresenta una linea17. Dal momento che le mosche sempre presentano un certo grado di circolarità (una Mosca non può apparire come una linea retta), il "Circularity_max" è impostata a 1 e l'impostazione "Circularity_min" è impostata a 0.4. È improbabile che l'utente deve modificare queste impostazioni.
La macro fa occasionalmente conteggio errori quando una Mosca si trova vicino al bordo della piattaforma. Ciò può verificarsi se le mosche non possono volare ma a piedi dentro e fuori il ROI definito dall'utente. Nella maggior parte dei casi, riselezionare il ROI (inserendolo per quanto possibile alla piattaforma) puoi risolvere facilmente questo problema. Tuttavia, lo script di "Isola analisi analisi" è in grado di rilevare e conteggi dati corretti improprio causato da mosche camminare dentro e fuori il ROI relativamente bene. Anche se la risoluzione della webcam presentato qui è abbastanza alta per discriminare mosche nelle immediate vicinanze abbastanza bene, abbiamo implementato algoritmi aggiuntivi nella procedura di elaborazione di immagine macro"Drosophila isola Assay", come la spartiacque ed erodere la funzione17. Questi facilitano la corretta delineazione di mosche che sono in stretta vicinanza sulla piattaforma. Inoltre, la macro è in grado di distinguere tra mosche che saltò dalla piattaforma o volarono lontano da esso. Tuttavia, generalmente si è osservato che sani giovane ceppi volare volano via immediatamente quando è sceso sulla piattaforma, mentre più grandi mosche e mosche con deficit motorio restano più a lunghi sulla piattaforma e verranno alla fine saltare o cadere dalla piattaforma. Nonostante queste limitazioni, il dosaggio e analisi forniscono una misura molto accurata del comportamento motorio.
Per garantire la performance di successo dello script "Isola test Analysis", l'utente deve assicurarsi di immettere i percorsi corretti per i file di input e outpui delle righe di script indicato nel protocollo e di fornire i dati nel formato di cartella corretta (come indicato nella Figura 2). Se l'utente rileva che i criteri utilizzati per filtrare i dati sperimentali inaffidabili troppo stringenti (riga 68: il primo valore nella colonna "Count" è minore o uguale a 5; row 71: il primo valore nella colonna "Count" è superiore al numero totale di mosche generata sulla platfo RM + 3), spegnere queste impostazioni filtro aggiungendo un # davanti il testo nelle righe 68 e 71 nello script "Isola test Analysis". In questo caso, tutti i set di dati verrà essere inclusi nell'analisi. In alternativa, è possibile modificare le impostazioni di filtro modificando i valori nelle righe 68 e 71 secondo i bisogni di utente. Possibili artefatti nei valori totali nella "results. txt" generato dalla macro"Drosophila isola Assay" possono anche essere regolati manualmente, e può eseguire nuovamente lo script sui dati impostati. Quando l'utente è interessato a l'elaborazione di più di 10 fps o più di 10 s di dati, il numero di fotogrammi elaborati dallo script "Isola analisi analisi" dovrebbeessere regolata. L'analisi statistica può essere sostituito anche da alternative definite dall'utente.
Una cartella denominata "Esempi isola Assay," contenente esempi con tempo-serie di immagini ottenute mediante il saggio dell'isola, può essere trovata presso il seguente sito Web: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Scarica il folder "Esempi isola Assay" e seguire i passaggi descritti nel presente protocollo per diventare rapidamente familiarizzato con la struttura di archiviazione di file, l'elaborazione delle immagini con la macro "Dosaggio di Drosophila Island" e il "isola analisi analisi" script.
Il dosaggio di isola, in combinazione con la macro sviluppata e script di analisi, può essere utilizzato per valutare e quantificare il comportamento del movimento aberrante di un modello di Drosophila dell'Atassia-Telangiectasia. Poiché il test può essere applicato in modo efficiente a varie età, è adatta ad analizzare la natura potenzialmente progressiva dei fenotipi.
In sintesi, il dosaggio di isola, in combinazione con la macro"Drosophila isola Assay" e lo script di "Isola test Analysis", è un dosaggio conveniente, affidabile e altamente efficiente per oggettivamente analizzare e quantificare i difetti dell'apparato locomotore di Drosofila modelli di disordini di movimento in un modo ad alta velocità.

Negli ultimi anni, i progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione hanno notevolmente contribuito all'identificazione di geni alla base di disturbi del movimento degenerativa del cervello (per esempio, l'atassia cerebellare e morbo di Parkinson), di un neurone periferico origine (ad esempio, la sclerosi laterale amiotrofica e la paraplegia spastica ereditaria) e di origine muscolare (ad es., distrofia muscolare di Duchenne e la distrofia miotonica)1,2,3,4 . Nonostante questo, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base della maggior parte di questi disturbi. Una migliore comprensione di questi meccanismi è essenziale per lo sviluppo di terapie.
Come nell'uomo, il movimento negli organismi di modello, come volo e locomozione in Drosophila, è controllato dalla centrale del cervello, sistema nervoso periferico e muscoli. Inoltre, il tempo di generazione veloce e toolbox genetica della drosofila rendono questo organismo di modello particolarmente adatto per lo screening di alto-rendimento di geni coinvolti nei disordini di movimento e per droga test5,6 . A causa del notevole numero di condizioni che devono essere testati in tali schermi, affidabili, convenienti e relative analisi semplice, come pure strumenti per quantificare i risultati di uscita in modo automatico, sono altamente desiderabili.
Schmidt et al. (2012) 7 descritto un test di basso costo chiamato il "saggio di isola" per valutare il comportamento motorio della drosofila . Il dosaggio di isola è stato utilizzato con successo in proiezioni su larga scala per identificare geni con funzioni specifiche glia7, nella valutazione dei modelli di Drosophila di disabilità intellettiva8e per la valutazione generale di volare il comportamento del motore9. Il disegno di principio del dosaggio isola consiste di una piattaforma elevata sul quale vengono generate diverse mosche. Questo induce un innato comportamento motore che consente sani mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Il test misura il numero di mosche restanti sulla piattaforma sopra tempo7,8,9. Tutte queste caratteristiche indicano che il dosaggio di isola può essere uno strumento di screening potente per geni coinvolti nei disordini di movimento.
Attualmente, l'analisi quantitativa dei dati di analisi filmata isola avviene manualmente7,8,9. Per migliorare l'efficienza del test, un metodo di basso costo è stato sviluppato per quantificare semi-automaticamente la fuga di mosche dalla piattaforma. Il programma di installazione utilizza una semplice webcam collegata a un computer portatile per raccogliere tempo immagine serie della piattaforma, con fotogrammi acquisiti ogni 0,1 s. telai vengono poi elaborati con la macro"Drosophila isola Assay" che quantifica il numero di mosche sulla piattaforma sopra tempo. La macro"Drosophila isola Assay" è diviso in tre sub-macro indipendente: (I) il "Crea stack e proiezione," Sub-macro identifica gli esperimenti differenti dell'isola memorizzati in diverse sottocartelle e crea uno stack e una proiezione di ciascuno serie temporali. (II) la Sub-macro "Piattaforma di definire" consecutivamente aprirà tutti i file "Projection_image_name.tif" presenti nelle singole sottocartelle sperimentale, al punto che all'utente è richiesto di definire manualmente la piattaforma dell'isola come la regione di interesse (ROI). (III) "analisi" quantifica automaticamente il numero di mosche restanti sulla piattaforma durante la serie temporale. Il sub-macro possono essere eseguite consecutivamente (in una sola volta) o in modo indipendente. Per l'analisi di dati statistici, uno script è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e applicare un test statistico per determinare se trattamenti/genotipi comportarsi significativamente differente da altro (Figura 1). Infine, è dimostrato che questa configurazione può essere utilizzata per valutare e quantificare la capacità dell'apparato locomotore aberrante di un modello di Drosophila per l'atassia-telangiectasia (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione contribuiscono all'identificazione di geni-malattia (candidato) per disturbi del movimento e altre malattie neurologiche a una velocità crescente. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa i meccanismi molecolari che sono alla base di questi disordini. Casella degli strumenti genetico, molecolare e comportamento di Drosophila melanogaster rende questo organismo di modello particolarmente utile per la caratterizzazione di nuovi geni-malattia e meccanismi in un modo ad alta velocità. Tuttavia, schermi ad alta velocità richiedono dosaggi efficienti ed affidabili che, idealmente, sono convenienti e consentire per la quantificazione automatizzata dei tratti rilevanti per questi disturbi. Il dosaggio di isola è un conveniente e facilmente il set-up metodo per valutare il comportamento motorio della drosofila . In questo saggio, mosche sono gettati in una piattaforma da un'altezza fissa. Questo induce una risposta motoria innata che consente le mosche fuggire dalla piattaforma in pochi secondi. Allo stato attuale, analisi quantitative di girato isola saggi sono fatto manualmente, che è un'impresa laboriosa, in particolare quando si eseguono grandi schermi.
Questo manoscritto descrive gli algoritmi"Drosophila isola Assay" e "Isola test Analysis" per high throughput, trattamento automatizzato di dati e la quantificazione dei dati di analisi di isola. Nell'impostazione di una semplice webcam collegata a un computer portatile raccoglie una serie di immagini della piattaforma mentre il test è eseguito. L'algoritmo di"Drosophila isola Assay" sviluppato per il software open-source Fiji elabora queste serie di immagine e quantifica, per ogni condizione sperimentale, il numero di mosche sulla piattaforma nel corso del tempo. Lo script di "Isola test Analysis", compatibile con il software gratuito R, è stato sviluppato per elaborare automaticamente i dati ottenuti e per calcolare se trattamenti/genotipi sono statisticamente differenti. Questo notevolmente migliora l'efficienza del test isola e rende una lettura potente per base locomozione e comportamento in volo. Così può essere applicato a grandi schermi indagando volare capacità dell'apparato locomotore, Drosophila modelli di disturbi del movimento e l'efficacia dei farmaci.

Nel protocollo descritto, Drosophila isola analisi dati sono acquisiti e trattati in tre passaggi. In primo luogo, la risposta di fuga del volo di Drosophila generata sulla piattaforma di isola è registrata con una webcam e memorizzata come immagini singole BMP (sezioni 1-7 del protocollo). In secondo luogo, la macro"Drosophila isola Assay" (passaggio 8) elabora i fotogrammi, generando un file di testo "result" (tabella 1), in cui si riassume il numero di oggetti rilevati in ogni fotogramma e una serie di immagini "Result_stack.tiff", che Mostra oggetti rilevati all'interno dell'area della piattaforma in ogni fotogramma. In terzo luogo, lo script di "Isola test Analysis" (protocollo sezione 9) elabora i dati macro memorizzati nei file "results. txt" dei singoli esperimenti. Diversi passaggi sono incorporate nello script per filtrare e combinare i dati per l'analisi statistica. Il primo fotogramma in cui vengono generate le mosche sulla piattaforma viene rilevato e considerato come punto di tempo 1. Fotogrammi precedenti vengono eliminati dal dataset. 100 fotogrammi successivi tempo punto 1 (corrispondente a 10 s) vengono selezionati per l'analisi. Esperimenti in cui il numero iniziale di mosche rilevato sulla piattaforma è più piccolo di 5 vengono automaticamente esclusi dall'analisi, eliminando risultati inaffidabili dagli esperimenti sottodimensionati. Sono esclusi anche gli esperimenti in cui il numero iniziale di mosche rilevato sulla piattaforma supera l'impostazione "Numero di mosche per flaconcino" più una tolleranza di 3. Questo elimina il DataSet in cui rumore particelle sono stati erroneamente rilevate come mosche. Lo script quindi calcola la percentuale di mosche rilevato per ciascun punto di tempo rispetto al più alto numero di mosche rilevato della serie. Errori nei DataSet causato dalle mosche camminare dentro e fuori il ROI (rilevato come una diminuzione seguita da un aumento della percentuale delle mosche sulla piattaforma nel corso del tempo) vengono corretti automaticamente da nei loro confronti come costantemente presenti sulla piattaforma nelle fasi precedenti . Tutti i DataSet replicati per una specifica condizione sperimentale che erano presenti nella directory principale sono combinati ed esportati nel file "data_all_conditions.csv". Le colonne rappresentano le variabili descritte nella tabella 2. Lo script esporterà anche un grafico per ogni condizione sperimentale, denominato secondo la cartella che contiene i dati. Questo grafico mostra la percentuale di mosche restanti sulla piattaforma nel corso del tempo (risposta di fuga di volo) per la sperimentale replica presenti nella rispettiva cartella (Figura 3A-B). La media, SD e SEM per ogni condizione sperimentale sono calcolati e riassunti nel file "Statistiche summary.csv". Un grafico a linee chiamato "Escape_response_all_conditions.tiff" Mostra la risposta di fuga media di volo per fino a 12 sperimentale condizioni presenti nella cartella principale di (Figura 3). Infine, l'area sotto la curva per tutte le condizioni sperimentali presenti nella cartella principale è calcolato e riassunti nel file "AUC.csv". A seconda del numero delle condizioni presenti nella cartella principale, lo script o eseguirà un spaiati Welch t-test a due code (2 condizioni) o un'ANOVA con correzione di Tukey per le prove multiple (più di 2 condizioni) determinare se la sperimentale le condizioni differiscono da significativamente da altro. Questi risultati sono riassunti in "Welch_t-test_results.txt" o "AUC_anova_results.txt." Quando si esegue l'ANOVA, lo script esporterà anche un file di "AUC_anova.tiff" che consente di visualizzare la differenza tra l'AUC media e gli intervalli di confidenza del 95% delle condizioni sperimentali che vengono confrontati. I valori dell'assoluto area sotto la curva dei replicati sperimentale per tutte le condizioni sperimentali vengono visualizzati come punti dati individuali con mediane in "AUC.tiff" (Figura 3D).
Atassia Telangiectasia (AT) è un disordine di movimento recessivo autosomal caratterizzato da precoce insorgenza di atassia cerebellare dovuto le mutazioni nel gene Atassia Telangiectasia mutato (ATM)14. Mutanti dell'ortologo di Drosophila di ATM, tefu, visualizzare i difetti in mobilità e longevità15. Per valutare la macro"Drosophila isola Assay", un modello di Drosophila di AT è stato testato nell'analisi della isola, e l'output dei dati della macro è stato confrontato con conteggi manuale dei dati. I risultati mostrano che onnipresente tefu atterramento (w-; Actin-Gal4/GD11950) riduce significativamente la capacità di queste mosche di lasciare la piattaforma rispetto ai controlli precedenti genetici (w-; Actin-Gal4/+) (Figura 4). Dopo 1 s, il 50% delle mosche controllo era fuggito la piattaforma, in contrasto con il &#60; 1% di tefu- RNAi vola. Cosa importante, i dati ottenuti con la macro fedelmente riprodotti i dati ottenuti da manuale contando, indicando che la macro è uno strumento affidabile che può essere utilizzato per la quantificazione dei dati di analisi di isola e la valutazione dei difetti di movimento ( Figura 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figura 1: diagramma di flusso che illustra i requisiti, procedura sperimentale e l'analisi del dosaggio isola. Attrezzature di analisi (A) isola. (B) messa a punto sperimentale per il dosaggio di isola. (C) Isola di dosaggio. (D) l'elaborazione dei dati di analisi di isola con la macro"Drosophila isola Assay". La macro"Drosophila isola Assay" è composto da 3 sub-macro: 1) fare stack e proiezione, 2) definire piattaforma e 3) analisi. (E) elaborazione e valutazione statistica dei dati utilizzando lo script di "Isola test Analysis". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figura 2: esempi di diverse regolazioni necessarie durante il protocollo. (A) la necessaria struttura di directory nella quale isola esperimenti di analisi devono essere conservati per analisi ed elaborazione dati. (B) quando si regolano le impostazioni video, mosche devono apparire nero su sfondo bianco. (C) file di output Image framecome salvato tramite il software di registrazione di immagini descritto in questo manoscritto. Muta (D), il giallo indica la selezione della piattaforma. La selezione della piattaforma memorizzati nel "ROI Manager" è evidenziata in blu. (E) mosche sono rappresentati come punti bianchi durante la regolazione di "impostazione dimensione minima di volare". La finestra dei risultati indica l'area delle mosche in pixel. (F) esempio di un fotogramma singolo immagine registrata (a sinistra) e il corrispondente nello stack dell'immagine risultante, ottenuti con la macro"Drosophila isola Assay" (a destra). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figura 3: risultato immagini ottenute dopo l'elaborazione di dati con "Isola analisi analisi" script. (A) linea grafico che mostra la risposta di fuga di volo per ogni controllo sperimentale replicare. (B) linea del grafico che mostra la risposta di fuga di volo per ogni replica sperimentale di tefu RNAi. Risposta di fuga (C) media di volo per condizioni sperimentali indicate; le barre di errore rappresentano le trame di Dot SEM. (D) che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per il controllo e condizioni mutante. Repliche sperimentali per entrambe tefu RNAi e controllo le condizioni vengono visualizzati come punti dati individuali (in nero) con mediane (linea rossa). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figura 4: Onnipresente tefu atterramento mosche mostrano una significativamente diminuita capacità di lasciare la piattaforma. i dati rappresentano la percentuale di mosche sulla piattaforma nel corso del tempo (s) per il controllo (w-; Actin-Gal4/+) e tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) Vola. (numero delle ripetizioni = 5; le barre di errore rappresentano la SEM). (A) dati grezzi ottenuti con la macro"Drosophila isola Assay". (B) Dot trame che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per controllo e tefu RNAi condizioni ottenute con la macro"Drosophila isola Assay" (Welch spaiati test t, * * p &#60; 0,01). (C) dati grezzi ottenuti manualmente contando il numero di mosche presenti sull'isola al secondo. (D) Dot trame che rappresenta l'area sotto la distribuzione della curva per il controllo e Tefu RNAi condizioni ottenute dal conteggio manuale (Welch spaiati test t, * * p &#60; 0,01). Le barre di errore rappresentano SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome della colonna</td>
			<td colspan="3">Descrizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetta</td>
			<td colspan="3">Nome del frame.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Il numero di oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superficie totale</td>
			<td colspan="3">Area totale di oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimensione media</td>
			<td colspan="3">Area totale di oggetti rilevati nel telaio diviso per il numero di oggetti entro i limiti della piattaforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Area</td>
			<td colspan="3">La percentuale di area occupata dagli oggetti rispetto all'area totale della piattaforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Perimetro totale degli oggetti rilevati nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volare dimensioni min.</td>
			<td colspan="3">Il minimo volare impostazione formato definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay" (in pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zona ROI</td>
			<td colspan="3">L'area della piattaforma (ROI) definita dall'utente durante l'esecuzione della Sub-macro definire piattaforma (in pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Numero di mosche</td>
			<td colspan="3">Il numero di mosche utilizzato per ogni esperimento definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay".</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Parametri misurati dalla macro"Drosophila isola Assay". i parametri descritti in questa tabella verranno visualizzata nel file "results. txt" al momento di eseguire la macro"Drosophila isola Assay".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome della colonna</td>
			<td colspan="3">Descrizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetta</td>
			<td colspan="3">Numero di frame.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Il numero di mosche rilevato nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Superficie totale delle mosche rilevato nella cornice entro i limiti della piattaforma (ROI) in pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volare dimensioni min.</td>
			<td colspan="3">Il minimo volare impostazione di voce di formato definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay" (in pixel).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zona ROI</td>
			<td colspan="3">L'area della piattaforma (ROI, in pixel) definita dall'utente quando si esegue la Sub-macro "definire la piattaforma".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Numero di mosche</td>
			<td colspan="3">Il numero di mosche utilizzato per ogni esperimento definito dall'utente nell'interfaccia grafica della macro"Drosophila isola Assay".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambiguous</td>
			<td colspan="3">% Vola presenti sulla piattaforma nel rispettivo fetta/frame rispetto al più alto numero di mosche rilevato sulla piattaforma durante l'esperimento.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">Punto di tempo 1 rappresenta il primo fotogramma devono essere analizzate e corrisponde al telaio dove le mosche prima appaiono sulla piattaforma. Ci sono un totale di 100 fotogrammi al replicare analizzati (corrispondente a 10 s, quando si utilizza le impostazioni descritte.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esperimento</td>
			<td colspan="3">Numero di ripetizioni per condizione.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condizione</td>
			<td colspan="3">Indica il nome della condizione sperimentale (secondo il nome definito dall'utente della cartella contenente i dati).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Descrizione delle variabili ottenute dopo l'elaborazione i dati con "Isola analisi analisi" script. I parametri descritti in questa tabella vengono visualizzati nel file "data_all_conditions.csv" al trattamento dei dati con lo script di "Isola test Analysis".

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High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Il metodo di isola è un relativamente nuovo, conveniente che può essere utilizzato per valutare il comportamento motorio di base di Drosophila melanogaster. Questo manoscritto descrive algoritmi per l'elaborazione dei dati automatica e quantificazione obiettiva dei dati di analisi isola, rendendo questo saggio una lettura sensibile, ad alta produttività per grandi schermi di genetici o farmacologici.

High-throughput analisi del comportamento motorio nell'analisi di Isola della drosofila

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