Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

Vi erkjenner Vienna Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager center (NIH P40OD018537) for å gi Drosophila stammer. Vi er takknemlige for Klämbt laboratorium for å introdusere oss til øya analysen og Martijn Eidhof for å bygge øya analysen oppsettet. Denne studien var i delen støttet av E-SJELDNE-3 felles transnasjonale kaller gi "Forbereder terapi for autosomalt recessiv ataxias" FORBERED (NWO 9003037604), av en topp grant (912-12-109) fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO), og ved to DCN/Radboud University Medical Center PhD stipend. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Denne protokollen beskriver"Drosophila øya analysen" makroen som kvantitativt vurderer Drosophila motor oppførsel under øya analysen. Makroen teller nøyaktig fluene på plattformen over tid, gjør øya analysen svært sensitive og egnet for kvantitative høy gjennomstrømming evaluering av locomotor defekter. Metodikken kan sammenligne betingelsene, med fluer dyrket under ulike genetiske og/eller miljømessige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne avlesning er derfor spesielt nyttig som oppdagelsesverktøy når utføre genetiske eller farmasøytiske storskjermer, når studere Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer, eller undersøke bevegelse eller fly oppførsel.
Øya analysen protokollen presentert i dette manuskriptet gir fordelene over eksisterende/alternativ metoder. For eksempel er video-sporing bevegelse mye mer tidkrevende og mindre egnet for testing store utvalgene. Øya analysen er en høy gjennomstrømming screening verktøyet, og i denne forstand, er sammenlignbar med rask interaktive negative geotaxis (RING) analysen16. Forskjellen mellom to er at øya analyser tillater påvisning av et bredere spekter av locomotor problemer; russernes fluer forlate plattformen kan skyldes feil i flyet, hopping, eller gå atferd forårsaket av vingen (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) feil. På den annen side, vurderer RING analysen defekter i klatring/gåing atferd skyldes etappe (muskel/neuronal) feil. Dersom brukerne er interessert i flere atferdsmessige readouts, kan øya analysen også kombineres med andre analyser, for eksempel RING analysen. I tillegg lasere kreves for optogenetics kan enkelt installeres i boksen øya analysen, og oppsettet er så enkel at den kan lett flyttes til et rom der temperaturen og lys kan kontrolleres.
For å sikre suksess og reproduserbarhet til øya analysen beskrevet her, bør flere anbefalinger følges. Aliquot og overføre fluene eksperimentell test ampuller på minst en dag før å unngå virkningene av CO2 eller kald anestesi. Ikke overfylle eksperimentelle hetteglass (bruker 10-15 fluer per medisinglass, er det best å alltid plassere samme antall fluer per medisinglass). Holde fluene på fersk mat til alle tider. Hvis ikke ennå kjent med gjennomføre analysen, praksis kaster flyr på plattformen å maksimere avkastningen. Også praksis raskt trekke hånden rett etterpå som det forstyrrer dataanalyse (bildeanalyse og fly teller start før hånden er ut av bildet). Holde de miljømessige og eksperimentelle forholdene identiske eksperimenter som skal sammenlignes (f.eks kontroller versus mutanter eller et genotype testet på ulike aldersgrupper). Alltid utføre eksperimenter på samme tid av dagen og opprettholde hetteglass under kontrollert temperatur og luftfuktighet. Statistisk makt, teste minst tre tekniske gjentak per biologiske replikere.
For å sikre vellykket ytelsen til makroen som beskrives her, webkamera og innstillinger må justeres for å oppnå maksimal kontrast: flyr vises som svarte objekter på en hvit plattform. Når antall fluer ikke regnes riktig makroen, justere kontrasten, se om Avkastningen er riktig valgt og sikre at flyr på plattformen er over angitte minimumsverdien fly innstillingen (se trinn 8.3 av denne protokollen). Innstillingene må bare defineres én gang. De gjelder for alle eksperimenter, som avstanden mellom webkameraet og plattformen ikke er endret. Circularity_min og maks innstillinger definerer circularity av partikler (partikler = telt fluer) som vil bli tatt i betraktning for analyse (flyr = telt objekter). 1 representerer en perfekt sirkel, og 0 representerer en linje17. Siden fluene presentere alltid en viss grad av circularity (et fly ikke kan vises som en rett linje), den "Circularity_max"-innstillingen er satt til 1 og innstillingen "Circularity_min" er satt på 0,4. Det er usannsynlig at du må justere disse innstillingene.
Makroen gjør noen ganger telling feil når en flue ligger nær grensen til plattformen. Dette kan skje hvis fluene ikke kan fly men spasertur av brukerdefinerte Avkastningen. Oftest kanne merke Avkastningen (montering det så mye som mulig til plattformen) lett oppklare problemet. Men skriptet "Øya analysen analyse" er kjøpedyktig merker og riktige feil data teller forårsaket av fluer gangavstand av Avkastningen relativt godt. Selv om oppløsningen til webkameraet presenteres her er høy nok til å diskriminere fluer i nærheten ganske godt, har vi implementert flere algoritmer i bildet behandlingen prosedyren for"Drosophila øya analysen" makroen, som den vannskille og eroderes funksjonen17. Disse lette riktig avgrensning av fluer i nærheten på plattformen. i tillegg makroen er ikke kan skille mellom fluene som hoppet fra plattformen eller fløy fra den. Likevel, det er vanligvis observert at friske unge fly stammer fly bort umiddelbart når slippes på plattformen, mens eldre fluer og fluer med locomotor underskudd forbli lenger på plattformen og vil til slutt hoppe eller faller av plattformen. Til tross for disse begrensningene gir analysen og analyse en svært nøyaktig grad av locomotor atferd.
For å sikre vellykket resultatene av skriptet "Øya analysen analyse", må brukeren sørge for å angi riktig banene for input og output filene i skript-rader som er angitt i protokollen og gi dataene i riktig mappe format (som angitt i figur 2). Hvis brukeren finner kriteriet for å filtrere ut upålitelige eksperimentelle data for strenge (rad 68: den første verdien i kolonnen "Teller" er mindre enn eller lik 5, rad 71: den første verdien i kolonnen "Teller" er høyere enn det totale antallet fluer kastet på platfo RM 3), slå av disse innstillingene ved å legge en # foran teksten i rader 68 og 71 i skriptet "Øya analysen analyse". I dette tilfellet inkluderes alle datasett i analysen. Eventuelt kan innstillinger endres ved å justere verdiene i radene med 68 og 71 i henhold til brukernes behov. Mulig gjenstander i telle verdiene i "results.txt" genereres"Drosophila øya analysen" makroen kan også justeres manuelt, og skriptet kan kjøres igjen på justert dataene. Når brukeren er interessert i behandling av mer enn 10 fps, eller mer enn 10 s data, antall rammer behandles av skriptet "Øya analysen analyse" børjusteres. Den statistiske analysen kan også bli erstattet av brukerdefinerte alternativer.
En mappe kalt "Eksempler øya analysen," som inneholder eksempler med bilde tidsserier får øya analysen, kan finnes på følgende nettsted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Last ned mappen "Eksempler øya analysen" og Følg fremgangsmåten beskrevet i denne protokollen for raskt bli kjent med strukturen for fillagring, behandling av bilder med makroen "Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" skriptet.
Øya analysen, kan i kombinasjon med utviklet makro og analyse skript, brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende bevegelse virkemåten til en Drosophila modell av ataksi-Telangiectasia. Siden analysen kan effektivt brukes til ulike aldre, er det godt egnet til å analysere fenotyper potensielt progressiv natur.
Oppsummert er øya analysen, i kombinasjon med makroen"Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" manuset, en kostnadseffektiv, pålitelig og svært effektiv analysen objektivt analysere og kvantifisere locomotor feil av Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser på en høy gjennomstrømming måte.

De siste årene, har fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi sterkt bidratt til identifisering av gener underliggende degenerative bevegelsesforstyrrelser av hjernen (f.eks lillehjernen ataksi og Parkinsons), for perifere neuronal opprinnelse (f.eks amyotrofisk lateral sklerose og arvelige spastisk paraplegia), og muskel opprinnelse (f.eks Duchenne muskeldystrofi og myotonic dystrophy)1,2,3,4 . Til tross for dette, er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for de fleste av disse lidelsene. En bedre forståelse av disse mekanismene er avgjørende for å utvikle terapier.
Som mennesker kontrollert bevegelse i modellen organismer, som fly og bevegelse i Drosophila, av den sentrale hjernen, perifere nervesystemet og muskler. I tillegg den rask generasjonstid og genetisk verktøykassen i Drosophila gjør denne modellen organismen spesielt egnet for høy gjennomstrømming screening av gener involvert i bevegelsesforstyrrelser og for narkotikatesting5,6 . På grunn av betydelig antall betingelser som må testes i slike skjermer, pålitelig, kostnadseffektiv, og relativt enkle analyser, samt verktøy for å kvantifisere output resultatene på en automatisert måte, er svært ettertraktet.
Schmidt et al. (2012) 7 beskrev en rimelig test kalt "øya analysen" evaluere Drosophila locomotor atferd. Øya analysen har blitt brukt med hell i store screenings for å identifisere gener glia-spesifikke funksjoner7i evalueringen av Drosophila modeller av intellektuelle handikap8, og for generell vurdering av fly motor atferd9. Prinsippet utformingen av øya analysen består av en opphøyet plattform som flere fluer blir kastet. Dette medfører en medfødt motor virkemåten som gir sunn fluer å flykte fra plattformen i sekunder. Analysen måler antallet flyr igjen på plattformen over tid7,8,9. Alle disse funksjonene indikerer at øya analysen kan være et kraftig screeningsverktøy for tilblivelse involvert inne bevegelsesforstyrrelser.
Foreløpig er kvantitativ analyse filmet øya analysen data gjort manuelt7,8,9. For å forbedre effektiviteten av analysen, ble en rimelig metode utviklet for å kvantifisere halvautomatisk rømning av fluer fra plattformen. Oppsettet bruker en enkel webcam koblet til laptop for å samle bilde tid serie plattformen, med rammer kjøpt hver 0,1 s. rammer behandles deretter med makroen"Drosophila øya analysen" som kvantifiserer antall fluer på plattformen over tid. Makroen"Drosophila øya analysen" er delt inn i tre uavhengige sub makroer: (I) "Opprett stabel og projeksjon," sub makro identifiserer ulike øya eksperimenter lagret i forskjellige undermapper og skaper en stabel og en projeksjon av hver tidsserier. (II) "Definere plattform" sub makroen åpnes fortløpende alle "Projection_image_name.tif" filer i enkelte eksperimentelle undermappene, da brukeren blir bedt om å definere manuelt øya plattformen som region av interesse (ROI). (III) "analyse" kvantifiserer automatisk antall flyr igjen på plattformen under tiden serien. Sub makroene kan kjøres etter hverandre (i en løpe) eller uavhengig. For statistiske dataanalyse utviklet et skript til å behandle automatisk innhentet data og bruke en statistisk test for å fastslå om behandlinger/genotyper oppfører seg vesentlig forskjellig fra hverandre (figur 1). Til slutt er det vist at dette oppsettet kan brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende locomotor evne til Drosophila modell for ataksi-telangiectasia (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi bidrar til identifisering av (kandidat) sykdom gener for bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer med en økende hastighet. Men er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for disse lidelser. Genetisk, molekylær og atferdsmessige verktøykassen i Drosophila melanogaster gjør denne modellen organismen spesielt nyttig å karakterisere ny sykdom gener og mekanismer på en høy gjennomstrømming måte. Likevel krever høy gjennomstrømming skjermene effektiv og pålitelig analyser at ideelt sett er kostnadseffektive og tillate den automatiske kvantifiseringen av egenskaper gjelder for disse lidelser. Øya analysen er en kostnadseffektiv og enkelt oppsett metoden for å evaluere Drosophila locomotor atferd. I denne analysen, blir fluer kastet på en plattform fra en fast høyde. Dette medfører en medfødt motor svar som gjør fluene å flykte fra plattformen i sekunder. I dag utføres kvantitative analyser av filmet øya analyser manuelt, som er en arbeidskrevende oppgave, spesielt når store skjermer.
Dette manuskriptet beskriver"Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" algoritmer for høy gjennomstrømming, automatisert databehandling og kvantifisering av øya analysen data. I oppsett samler en enkel webcam koblet til laptop en bilde serie plattformen mens analysen utføres. "Drosophila øya analysen" algoritme utviklet for åpen kildekode programvare Fiji behandler disse bildet serien og kvantifiserer, for hver eksperimentelle tilstand, antall fluer på plattformen over tid. "Øya analysen analyse" skriptet, kompatibel med gratisprogrammet R, utviklet automatisk behandle innhentet data og beregne om behandlinger/genotyper er statistisk forskjellige. Dette sterkt forbedrer effektiviteten til øya analysen og gjør det en kraftig avlesning for grunnleggende bevegelse og fly atferd. Det kan derfor brukes til store skjermer undersøker fly locomotor evne, Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser, og narkotika effekt.

I beskrevet protokollen, er Drosophila øya analysen data kjøpt og behandlet i tre trinn. Først fly escape svar Drosophila kastet på øya plattformen registreres med et webkamera og lagres som individuelle BMP-bilder (protokollen seksjoner 1-7). Andre behandler"Drosophila øya analysen" makroen (trinn 8) rammene, generere en "result.txt" tekstfil (tabell 1), som antall objekter i hver ramme summeres, og en bildestakk "Result_stack.tiff", som viser objektene funnet innenfor området for plattformen i hver ramme. Tredje behandler "Øya analysen analyse" skriptet (protocol delen 9) makro data lagret i "results.txt" filene personlige eksperimenter. Flere trinn er innlemmet i manuset for å filtrere og kombinere data for statistisk analyse. Den første rammen der fluene blir kastet på plattformen oppdages og betraktet som punkt 1. Tidligere rammer elimineres fra datasettet. 100 rammer følgende tid punkt 1 (tilsvarer 10 s) er valgt for analyse. Eksperimenter der det opprinnelige antallet fluer oppdaget på plattformen er mindre enn 5 er automatisk utelukket fra analysen, eliminere upålitelige resultater fra underpowered eksperimenter. Eksperimenter som første fluer oppdaget på plattformen overskrider innstillingen "Antall fluer per medisinglass" pluss en toleranse for 3 utelates også. Dette eliminerer datasett i som støy partikler ble feilaktig oppdaget som fluer. Skriptet beregner prosenten av fluer oppdaget for hvert punkt sammenlignet med flest fluer i serien. Feil i datasett forårsaket av fluer gangavstand av Avkastningen (oppdaget en nedgang etterfulgt av en økning i prosentandelen av fluer på plattformen over tid) er automatisk korrigert av om dem som konsekvent tilstede på plattformen på tidligere stadier . Alle Repliker datasett for en bestemt eksperimentelle tilstand som fantes i hoved-katalogen er kombinert og eksportert til filen "data_all_conditions.csv". Kolonnene representerer variablene beskrevet i tabell 2. Skriptet eksporterer også et linjediagram for hver eksperimentelle tilstand, oppkalt etter mappen som inneholder dataene. Denne grafen viser prosent av fluer igjen på plattformen over tid (flight escape svar) for den eksperimentelle replikerer finnes i mappen respektive ((figur 3A)-B). Mening, SD, og SEM for hver eksperimentelle betingelse beregnes og oppsummert i filen "Statistikk summary.csv". Et linjediagram kalt "Escape_response_all_conditions.tiff" viser gjennomsnittlig flight escape svaret for opptil 12 eksperimentelle forhold finnes i hovedmappen ()Figur 3 c). Endelig området under kurven for alle eksperimentelle forhold i hovedmappen beregnes og oppsummert i filen "AUC.csv". Hvor mange av betingelser i hovedmappen, skriptet vil utføre en tosidig kort Welch t-test (2 betingelser) eller en VARIANSANALYSE med Tukey korreksjon for flere tester (mer enn 2 betingelser) å fastslå om den eksperimentelle vilkårene avviker vesentlig fra hverandre. Disse resultatene oppsummeres i "Welch_t-test_results.txt" eller "AUC_anova_results.txt." Når du utfører VARIANSANALYSE, eksporterer skriptet også en "AUC_anova.tiff" fil som viser forskjellen i gjennomsnittet AUC og 95% sikkerhet intervaller av eksperimentelle forhold som sammenlignes. Verdiene for absolutt området under kurven av de eksperimentelle replikat for alle eksperimentelle forhold vises som individuelle datapunkter med medians i "AUC.tiff" (figur 3D).
Ataksi Telangiectasia (AT) er en autosomal recessiv bevegelighet lidelse preget av tidlig debut av lillehjernen ataksi på grunn av mutasjoner i den ataksi Telangiectasia mutert (ATM) genet14. Mutanter av Drosophila orthologue av ATM, tefu, vise feil i mobilitet og lang levetid15. For å vurdere makroen"Drosophila øya analysen", en Drosophila modell av AT ble testet i øya analysen, og dataene utgangen av makroen var i forhold til manuelle teller. Resultatene viser at allestedsnærværende tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) betydelig reduserer muligheten for disse fluene å la på plattformen sammenlignet med sine genetisk bakgrunn kontroller (w-; Actin-Gal4/+) (Figur 4). Etter 1 s, 50% av kontroll fluene hadde rømt plattformen, i motsetning til den &#60; 1% av tefu- RNAi fluer. Viktigere, innhentet med makroen trofast gjengitt dataene innhentet av manuelle telle, indikerer at makroen er et pålitelig verktøy som kan brukes for kvantifisering av øya analysen data og evaluering av bevegelsen feil ( ) Figur 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figur 1: flytskjema som viser kravene, eksperimentelle prosedyren, og analyse av øya analysen. (A) øya analysen utstyr. (B) eksperimentelle oppsett for øya analysen. (C) øya analysen. (D) behandling av øya analysen data med makroen"Drosophila øya analysen". Makroen"Drosophila øya analysen" består av 3 sub makroer: 1) kontroller stabelen og projeksjon, 2) definere plattform og 3) analyse. (E) behandling og statistiske evalueringer av data ved hjelp av skriptet "Øya analysen analyse". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figur 2: eksempler på forskjellige justeringer kreves under protokollen. (A) den nødvendige mappestrukturen som øya analysen eksperimenter må lagres for databehandling og analyse. (B) når du justerer videoinnstillingene, fluer må vises svarte på hvit bakgrunn. (C) bilderammen utdatafilerlagret av bilde-opptak beskrevet i dette manuskriptet. (D) gule omriss viser valget som plattform. Lagrede plattform utvalget i "Avkastningen Manager" er uthevet i blått. (E) flyr vises som hvite prikker under justering av "fly minimumsstørrelse innstillingen." Resultatvinduet viser området fluene i piksler. (F) eksempel på en enkelt innspilt bilde ramme (på venstre) og den tilhørende rammen i den resulterende bildestakk, med makroen"Drosophila øya analysen" (til høyre). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figur 3: resultatet bilder innhentet etter behandling med "Øya analysen analyse" scriptet (A) linje graf som viser flight escape respons for hver kontroll eksperimentelle replikere. (B) linje graf viser flight escape svaret for hver tefu RNAi eksperimentelle replikere. (C) gjennomsnittlig flight escape respons for angitte eksperimentelle forhold; feilfeltene representerer SEM. (D) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og mutant forhold. Eksperimentell gjentak for både tefu RNAi og kontroll forhold vises som individuelle datapunkter (i svart) med medians (rød linje). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figur 4: Allestedsnærværende tefu knockdown fluer viser en betydelig redusert evne til å forlate plattformen. Dataene representerer prosent av fluer på plattformen over tid (s) for kontrollen (w-; Actin-Gal4/+) og tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) flyr. (tall av replikat = 5; feilfeltene representerer SEM). (A) rå data innhentet med makroen"Drosophila øya analysen". (B) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og tefu RNAi forhold med makroen"Drosophila øya analysen" (Welch unpaired t-test, ** p &#60; 0,01). (C) rådata ved manuelt å telle antall flyr finnes på øya per sekund. (D) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og Tefu RNAi forhold innhentet av hånd-telling (Welch unpaired t-test, ** p &#60; 0,01). Feilfeltene representerer SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolonnenavn</td>
			<td colspan="3">Beskrivelse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skive</td>
			<td colspan="3">Navnet på rammen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antall</td>
			<td colspan="3">Antall objekter i rammen innenfor rammene av plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Areal</td>
			<td colspan="3">Totalt areal på objektene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gjennomsnittlig størrelse</td>
			<td colspan="3">Totalt areal på objektene oppdaget inne rammen delt på antall objekter innenfor rammene av plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Området</td>
			<td colspan="3">Prosenten av område okkupert av objektene forhold til det totale arealet av plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Totalt omkretsen av objektene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyr størrelse</td>
			<td colspan="3">Minimum fly innstillingen definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen" (i piksler).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området avkastning</td>
			<td colspan="3">Området av plattformen (ROI) defineres av brukeren under kjøring av makroen sub definere plattform (i piksler).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antall fluer</td>
			<td colspan="3">Antall fluer brukes per eksperiment definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen".</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Parametere målt ved makroen"Drosophila øya analysen". Parameterne som beskrives i denne tabellen vises i filen "resultat.txt" ved"Drosophila øya analysen" makroen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolonnenavn</td>
			<td colspan="3">Beskrivelse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skive</td>
			<td colspan="3">Bildenummer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antall</td>
			<td colspan="3">Antall fluer oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Totalt areal på fluene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyr størrelse</td>
			<td colspan="3">Minimum fly posten innstillingen definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen" (i piksler).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området avkastning</td>
			<td colspan="3">Området av plattformen (ROI, i piksler) defineres av brukeren når sub-makroen "Definer plattform".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antall fluer</td>
			<td colspan="3">Antall fluer brukes per eksperiment definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% flyr tilstede på plattformen i respektive skive/rammen i forhold til det høyeste antallet fluer oppdaget på plattformen under eksperimentet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">Punkt 1 representerer den første rammen å bli analysert og tilsvarer rammen hvor fluene først vises på plattformen. Det er totalt 100 bilder per replikere analysert (tilsvarer 10 s, når du bruker innstillingene som beskrevet ovenfor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksperimentet</td>
			<td colspan="3">Antall gjentak per betingelse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tilstand</td>
			<td colspan="3">Angir navnet på eksperimentell tilstanden (ifølge brukerdefinerte navnet på mappen som inneholder dataene).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: beskrivelse av variablene innhentet etter behandling data med "Øya analysen analyse" scriptet Parameterne som beskrives i denne tabellen vises i filen "data_all_conditions.csv" ved behandling av data med skriptet "Øya analysen analyse".

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Øya analysen er en relativt ny, kostnadseffektiv analysen som kan brukes til å evaluere den grunnleggende locomotor virkemåten til Drosophila melanogaster. Dette manuskriptet beskriver algoritmer for automatisk databehandling og objektiv måling av øya analysen data, gjør denne analysen en følsom, høy gjennomstrømming avlesning for genetisk eller farmakologiske storskjermer.

Høy gjennomstrømming analyse av Locomotor atferd i Drosophila øya analysen

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder til Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly analysen for Foraging Behavior i<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Fastsettelse av Spontan Locomotor aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Høy gjennomstrømning analyse for å undersøke Eggleggingen Preferences av Individuell<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En enkel måte å måle endringer i Reward-søkende atferd med<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kvantifisering av Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...