Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
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Reconhecemos que o centro de recursos de drosófila de Viena e Bloomington Drosophila estoque centro (NIH P40OD018537) para fornecer estirpes de Drosophila . Estamos gratos ao laboratório Klämbt por nos apresentar para o ensaio da ilha e Martijn Eidhof para a construção da instalação de ensaio de ilha. Este estudo foi em parte apoiado pela chamar transnacionais conjuntas E-rara-3 conceder "Preparando-se para as ataxias recessivas autossômicas terapias" PREPARE (NWO 9003037604), por uma concessão superior (912-12-109) da organização do Países Baixos para a pesquisa científica (NWO) e por duas bolsas DCN/Radboud University Medical Center PhD. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Este protocolo descreve a macro"Drosophila ilha ensaio" que avalia quantitativamente o comportamento motor de Drosophila durante o ensaio da ilha. A macro conta com precisão as moscas na plataforma ao longo do tempo, tornando o ensaio da ilha altamente sensível e adequado para avaliação quantitativa do elevado-throughput de defeitos do aparelho locomotoras. A metodologia permite a comparação de qualquer condição, com moscas cultivadas sob diferentes condições genéticas e/ou ambientais, incluindo a exposição da droga. Esta leitura é, portanto, particularmente útil como ferramenta de descoberta ao realizar grandes telas genéticas ou farmacêuticas, quando estudar modelos da drosófila de distúrbios do movimento e outras doenças neurológicas, ou aquando da análise de locomoção ou voo comportamento.
O protocolo de ensaio ilha apresentado neste manuscrito fornece vantagens sobre os métodos existentes/alternativa. Por exemplo, a locomoção de controle de vídeo é muito mais demorado e menos apropriado para o teste de tamanhos de amostra grande. O ensaio da ilha é uma ferramenta de seleção da elevado-produção e, neste sentido, é comparável com o ensaio de geotaxis negativo interativo rápida (anel)16. A diferença entre os dois é que os ensaios da ilha permite a detecção de uma gama mais ampla de problemas de locomoção; a incapacidade de moscas para deixar a plataforma pode ser causada por defeitos em voo, saltando, ou andando de comportamento causada pela asa (músculo/neuronal) e/ou perna (músculo/neuronal) defeitos. Por outro lado, o ensaio do anel avalia defeitos de comportamento escalada/caminhada causadas por defeitos de perna (músculo/neuronal). No caso de usuários estão interessados em múltiplas leituras comportamentais, o ensaio da ilha também facilmente pode ser combinado com outros ensaios, tais como o ensaio do anel. Além disso, laser necessário para optogenetics pode ser facilmente instalado na caixa de ensaio da ilha, e a instalação é tão simples que facilmente podem ser movido para uma sala onde a temperatura e a luz podem ser controladas.
Para garantir o sucesso e a reprodutibilidade do ensaio ilha descrita aqui, várias recomendações devem ser seguidas. Alíquota e transferência as moscas para o teste experimental frascos pelo menos um dia antes do experimento para evitar os efeitos da anestesia de CO2 ou frio. Não sobrecarregar os frascos experimentais (usar moscas de 10-15 por frasco; é melhor colocar sempre o mesmo número de moscas por frasco). Manter as moscas em alimentos frescos em todos os momentos. Se não ainda familiarizado com a realização do ensaio, prática jogando voa na plataforma para maximizar o rendimento. Também praticar retraindo rapidamente a mão logo depois, como ela interfere com a análise de dados (análise de imagem e mosca contando o início somente depois que a mão está fora do quadro). Manter as condições ambientais e experimentais idênticas em experiências que precisam ser comparados (por exemplo, controles versus mutantes ou um genótipo testaram em diferentes idades). Sempre realizar os experimentos ao mesmo tempo do dia e manter os frascos sob condições de umidade e temperatura controlada. Para poder estatístico, o teste de pelo menos três repetições técnicas por replicar biológica.
Para assegurar a execução bem sucedida da macro descrita aqui, configurações de webcam e a imagem devem ser ajustadas para atingir o máximo contraste: voa aparecendo como objetos pretos em uma plataforma de branco. Quando o número de moscas corretamente não é contado pela macro, ajuste as configurações de contraste, verifique se o ROI está selecionado corretamente e certifique-se de que o tamanho das moscas na plataforma é acima do mínimo especificado voar tamanho configuração (consulte a etapa 8.3 do presente protocolo). As configurações só precisam ser definido uma vez. São aplicáveis a todas as experiências, contanto que a distância entre a plataforma e a webcam não é alterada. O Circularity_min e configurações máximas definem a circularidade das partículas (partículas = contadas moscas) que irá ser tidos em conta para a análise (voa = objetos contados). 1 representa um círculo perfeito, e 0 representa uma linha17. Uma vez que as moscas sempre apresentam um certo grau de circularidade (uma mosca não pode aparecer como uma linha reta), a definição de "Circularity_max" é definida de 1 e a definição de "Circularity_min" é definida de 0,4. É improvável que o usuário precisa ajustar essas configurações.
A macro ocasionalmente faz contagem de erros quando uma mosca está localizada perto da fronteira da plataforma. Isso pode ocorrer se as moscas não voam mas andar dentro e fora o ROI de definido pelo usuário. Na maioria dos casos, forem o ROI (montagem tanto quanto possível para a plataforma) pode facilmente resolver esse problema. No entanto, o roteiro de "Ilha do ensaio análise" é capaz de detectar e contagens de dados corretos imprópria causaram por moscas andar dentro e fora do ROI relativamente bem. Embora a resolução da webcam apresentada aqui é alta o suficiente para discriminar moscas nas proximidades razoavelmente bem, nós implementamos algoritmos adicionais no processo de processamento de imagem da macro"Drosophila ilha ensaio", tais como o bacias hidrográficas e corroer a função17. Estas facilitam a adequada delimitação das moscas que ficam nas proximidades da plataforma. Além disso, a macro é incapaz de distinguir entre moscas que pulou da plataforma ou voaram longe. No entanto, geralmente observa-se que cepas de mosca jovens saudáveis voam imediatamente quando caiu da plataforma, Considerando que moscas mais velhas e moscas com défices locomotoras permanecem por mais tempo na plataforma e serão eventualmente saltar ou cair fora da plataforma. Apesar dessas limitações, o ensaio e análise fornecem uma medida muito precisa de comportamento locomotor.
Para garantir a execução bem-sucedida do script "Ilha ensaio análise", o usuário tem que certificar-se de inserir os caminhos corretos para os arquivos de entrada e saídos nas linhas roteiro indicados no protocolo e fornecer os dados no formato de pasta correta (conforme indicado na Figura 2). Se o usuário encontra os critérios usados para filtrar dados experimentais confiáveis demasiado rigorosos (linha 68: o primeiro valor na coluna "Contar" é menor ou igual a 5; linha 71: o primeiro valor na coluna "Contagem" é maior do que o número total de moscas lançada sobre o Epics RM + 3), desligar essas configurações de filtro adicionando um # na frente o texto em linhas 68 e 71 no script "Ilha ensaio análise". Neste caso, todos os conjuntos de dados serão incluídos na análise. Alternativamente, as configurações de filtro podem ser alteradas, ajustando os valores nas linhas 68 e 71 de acordo com as necessidades do usuário. Possíveis artefatos em valores de contagem no "Results" gerado pela macro"Drosophila ilha ensaio" também podem ser ajustados manualmente, e o script pode ser executado novamente os dados ajustados. Quando o usuário está interessado no processamento de mais de 10 fps, ou mais de 10 s de dados, o número de quadros processados pelo script "Ilha ensaio análise" deveser ajustada. A análise estatística também pode ser substituída por alternativas definidas pelo usuário.
Uma pasta chamada "Exemplos ilha do ensaio," que contém exemplos com imagem séries temporais obtidas usando o ensaio da ilha, pode ser encontrada no seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Baixar a pasta "Exemplos ilha ensaio" e siga os passos descritos no presente protocolo rapidamente tornar-se familiarizado com a estrutura de armazenamento de arquivos, o processamento das imagens com a macro "Ensaio de Drosophila ilha" e a análise de ensaio"ilha" script.
O ensaio da ilha, em combinação com a macro desenvolvida e roteiro de análise, pode ser usado para avaliar e quantificar o comportamento aberrante de movimento de um modelo de drosófila de Ataxia-Telangiectasia. Desde que o ensaio pode ser aplicado eficientemente para várias idades, é bem adequado para analisar a natureza potencialmente progressiva dos fenótipos.
Em resumo, o ensaio da ilha, em combinação com a macro"Drosophila ilha ensaio" e o roteiro de "Análise do ensaio de ilha", é um ensaio altamente eficiente, confiável e econômico objetiva analisar e quantificar locomotoras defeitos de Drosófila modelos de distúrbios de movimento de uma forma de alta produtividade.

Nos últimos anos, avanços em tecnologias de próxima geração de sequenciamento contribuíram grandemente para a identificação de genes subjacentes transtornos degenerativa do cérebro (por exemplo, ataxia cerebelar e a doença de Parkinson), de periférico neuronal origem (por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica e paraplegia espástica hereditária) e de origem muscular (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne e distrofia miotônica)1,2,3,4 . Apesar disso, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares que sustentam a maioria destes transtornos. Uma melhor compreensão desses mecanismos é essencial para o desenvolvimento de terapias.
Como em humanos, movimento em organismos-modelo, como voo e locomoção em Drosophila, é controlado pelo cérebro central, sistema nervoso periférico e músculos. Além disso, o tempo de geração rápida e caixa de ferramentas genética da Drosophila tornam este organismo modelo particularmente adequado para o rastreio de alto rendimento de genes envolvidos em distúrbios do movimento e para5,6 de testes de drogas . Devido ao número substancial de condições que precisam ser testados em tais telas, confiáveis e econômicas e ensaios simples relativos, bem como ferramentas para quantificar os resultados de saída de forma automatizada, são altamente desejáveis.
Schmidt et al . (2012) 7 descreveu um teste de baixo custo chamado ensaio de"ilha" para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila . O ensaio da ilha tem sido usado com sucesso em seleções em grande escala para identificar os genes com funções específicas glia7, na avaliação dos modelos de drosófila de deficiência intelectual8e para a avaliação geral de Voe de comportamento motor9. O design do princípio do ensaio ilha consiste em uma plataforma elevada sobre a qual são lançadas várias moscas. Isto induz um comportamento motor inato que permite saudáveis moscas escapar da plataforma dentro de segundos. O teste mede o número de moscas, permanecendo na plataforma sobre tempo7,8,9. Todas estas características indicam que o ensaio da ilha pode ser uma ferramenta poderosa de triagem para genes envolvidos em distúrbios do movimento.
Atualmente, a análise quantitativa dos dados de ensaio filmado ilha é feita manualmente7,8,9. Para melhorar a eficiência do ensaio, um método de baixo custo foi desenvolvido para quantificar semi-automática a fuga de moscas da plataforma. A instalação usa uma simples webcam conectada a um computador portátil para recolher imagem tempo série da plataforma, com quadros adquiridos a cada 0.1 s. quadros são processados em seguida com a macro"Drosophila ilha ensaio" que quantifica o número de moscas na plataforma sobre está na hora. A macro"Drosophila ilha ensaio" é dividida em três macros sub independentes: (I) o "Create pilha e projeção," macro sub identifica experiências diferentes ilha armazenadas nas subpastas diferentes e cria uma pilha e uma projeção de cada um série de tempo. (II) a macro sub "Definir a plataforma" consecutivamente abrirá todos os arquivos "Projection_image_name.tif", localizados nas subpastas individuais experimentais, no ponto em que o usuário é solicitado para definir manualmente a plataforma da ilha como a região de interesse (ROI). (III) "análise" automaticamente quantifica o número de moscas restante na plataforma durante o período de tempo. O sub macros podem ser executado consecutivamente (em uma corrida) ou de forma independente. Para análise estatística dos dados, um script foi desenvolvido para processar automaticamente os dados obtidos e aplicar um teste estatístico para determinar se os tratamentos/genótipos se comportam significativamente diferentes entre si (Figura 1). Finalmente, está demonstrado que esta configuração pode ser usada para avaliar e quantificar a capacidade de locomoção aberrante de um modelo de drosófila para ataxia-telangiectasia (AT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Avanços em tecnologias de sequenciamento de última geração contribuem para a identificação de genes de doença (candidato) para distúrbios do movimento e outras doenças neurológicas, a uma velocidade crescente. No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares que estão subjacentes a esses transtornos. A caixa de ferramentas comportamental, molecular e genética da Drosophila melanogaster faz com que este organismo modelo particularmente útil para caracterizar a nova doença de genes e mecanismos de forma elevado-throughput. No entanto, telas de alta produtividade exigem ensaios eficientes e confiáveis que, idealmente, são cost-effective e permitir a quantificação automatizada dos traços relevantes para esses transtornos. O ensaio da ilha é um rentável e facilmente de set-up método para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila . Neste ensaio, moscas são lançadas em uma plataforma de uma altura fixa. Isso induz uma resposta inata de motor que permite que as moscas escapar da plataforma dentro de segundos. Neste momento, análises quantitativas dos ensaios ilha filmadas são feitas manualmente, que é um empreendimento laborioso, particularmente ao realizar grandes ecrãs.
Este manuscrito descreve os algoritmos"Drosophila ilha ensaio" e "Ilha do ensaio análise" para alta produtividade, processamento automatizado de dados e quantificação de dados de ensaio da ilha. No menu configuração, uma simples webcam conectada a um computador portátil recolhe uma série de imagem da plataforma enquanto o ensaio é realizado. O algoritmo de"Drosophila ilha ensaio" desenvolvido para o software open-source Fiji processa estas séries de imagem e quantifica, para cada condição experimental, o número de moscas na plataforma ao longo do tempo. O roteiro de "Ilha do ensaio análise", compatível com o software livre R, foi desenvolvido para processar automaticamente os dados obtidos e calcular se tratamentos/genótipos são estatisticamente diferentes. Isto grandemente melhora a eficiência do ensaio ilha e torna uma leitura poderosa para locomoção básica e comportamento de voo. Assim, pode ser aplicado para telas grandes investigando voar capacidade locomotora, modelos da drosófila de distúrbios do movimento e a eficácia da droga.

No protocolo descrito, dados de ensaio de ilha de Drosophila são adquiridos e processados em três etapas. Em primeiro lugar, a resposta de fuga de voo de Drosophila lançada para a plataforma da ilha é gravada com uma webcam e armazenada como imagens individuais. bmp (seções de protocolo 1-7). Em segundo lugar, a macro"Drosophila ilha ensaio" (passo 8) processa os quadros, gerando um arquivo de texto "result" (tabela 1), em que o número de objetos detectados em cada quadro é resumido e uma pilha de imagem "Result_stack.tiff", que mostra os objectos detectados dentro da área da plataforma em cada quadro. Em terceiro lugar, o roteiro de "Ilha do ensaio análise" (protocolo seção 9) processa os dados de macro armazenados nos arquivos de "Results" das experiências individuais. Vários passos são incorporados no script para filtrar e combinar os dados para a análise estatística. O primeiro quadro em que as moscas são lançadas na plataforma é detectado e considerado como o ponto do tempo 1. Quadros anteriores são eliminados do conjunto de dados. 100 frames seguindo tempo ponto 1 (correspondente a 10 s) são selecionados para análise. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma é menor do que 5 são excluídas automaticamente a partir da análise, eliminando resultados não-confiáveis de experimentos de fraca potência. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma excede a configuração de "Número de moscas por frasco", mais uma tolerância de 3 são também excluídas. Isso elimina os conjuntos de dados no qual ruído partículas erroneamente foram detectadas como moscas. O script, em seguida, calcula a porcentagem de moscas detectado para cada ponto de tempo em comparação com o maior número de moscas detectado na série. Em conjuntos de dados causados por moscas andar dentro e fora do ROI (detectado como um decréscimo seguido por um aumento da percentagem de moscas na plataforma, ao longo do tempo) são automaticamente corrigidos os erros por considerando-os como consistentemente presente na plataforma em fases anteriores . Todos os conjuntos de dados replicar para uma determinada condição experimental que estavam presentes no diretório principal são combinados e exportados para o arquivo "data_all_conditions.csv". Suas colunas representam as variáveis descritas na tabela 2. O script também irá exportar um gráfico de linha para cada condição experimental, nomeado de acordo com a pasta que contém os dados. Este gráfico mostra a porcentagem de moscas, permanecendo na plataforma, ao longo do tempo (resposta de fuga de voo) para o experimental Replica presente na pasta respectiva (Figura 3A-B). A média, SD e SEM para cada condição experimental são calculados e resumidas no arquivo "Summary.csv de estatísticas". Um gráfico de linha, chamado "Escape_response_all_conditions.tiff" mostra a resposta de fuga de voo média para até 12 experimental condições presentes na pasta principal, a (Figura 3). Finalmente, a área sob a curva para todas as condições experimentais presentes na pasta principal é calculada e resumida no arquivo "AUC.csv". Dependendo do número de condições presentes na pasta principal, o script irá realizar também um bicaudal pareado Welch-teste t (2 condições) ou uma ANOVA com correção de Tukey para vários testes (mais de 2 condições) determinar se o experimental condições diferem entre si significativamente. Esses resultados estão resumidos no "Welch_t-test_results.txt" ou "AUC_anova_results.txt." Ao realizar a ANOVA, o script também irá exportar um arquivo de "AUC_anova.tiff" que exibe a diferença entre a média AUC e os intervalos de confiança de 95% das condições experimentais que são comparados. Os valores da área total sob a curva das repetições experimentais para todas as condições experimentais são exibidos como pontos de dados individuais com medianas em "AUC.tiff" (Figura 3D).
Ataxia Telangiectasia (AT) é uma desordem autossômica recessiva movimento caracterizada por início precoce de ataxia cerebelar devido a mutações no gene Ataxia Telangiectasia mutado (ATM)14. Mutantes da Drosophila orthologue de ATM, tefu, exibem defeitos em mobilidade e longevidade15. Para avaliar a macro "Ensaio de ilha dedrosófila" , um modelo de Drosophila da AT foi testado no ensaio de ilha, e a saída de dados da macro foi comparado com a contagem manual de dados. Os resultados mostram que onipresente tefu nocaute (w–; Actin-Gal4/GD11950) diminui significativamente a capacidade dessas moscas para deixar a plataforma em comparação com seus controles de fundo genético (w–; Actin-Gal4/+) (Figura 4). Depois de 1 s, 50% das moscas controle tinha escapado da plataforma, em contraste com o &#60; 1% de tefuRNAi - voa. Importante, os dados obtidos com a macro fielmente reproduzidos os dados obtidos pelo manual, contando, indicando que a macro é uma ferramenta confiável que pode ser usada para a quantificação dos dados de ensaio da ilha e a avaliação de defeitos do movimento ( Figura 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figura 1: fluxograma descrevendo os requisitos, procedimento experimental e análise do ensaio ilha. (A) ilha do ensaio o equipamento. (B) instalação Experimental para o ensaio da ilha. (C) ilha do ensaio. (D) processamento de dados de ensaio ilha com a macro"Drosophila ilha ensaio". A macro"Drosophila ilha ensaio" é composta de 3 macros sub: 1) fazer a pilha e projeção, 2) definem plataforma e 3) a análise. (E) processamento e avaliação estatística de dados usando o script de "Análise do ensaio de ilha". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figura 2: exemplos de diferentes ajustes necessários durante o protocolo de. (A) a necessária estrutura de diretórios em que ilha experimentos de ensaio devem ser armazenados para processamento de dados e análise. (B) ao ajustar as configurações de vídeo, devem aparecer moscas preto sobre um fundo branco. (C) quadro de imagem arquivos de saídacomo salvo pelo software de gravação de imagem descrito neste manuscrito. Estrutura de tópicos (D), o amarelo mostra a seleção de plataforma. A seleção de plataforma armazenado no "ROI Manager" é destacada em azul. (E) moscas são representadas como pontos brancos durante a adaptação do "mosca tamanho mínimo ajuste." A janela de resultados mostra a área das moscas em pixels. (F) exemplo de uma moldura única imagem gravada (à esquerda) e o correspondente quadro na pilha de imagem resultante, obtido com a macro"Drosophila ilha ensaio" (à direita). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figura 3: imagens do resultado obtido após o processamento de dados com o roteiro de "Ilha do ensaio análise" (A) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada controle experimental replicar. (B) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada tefu RNAi experimental replicar. (C) resposta de fuga de voo médio indicadas condições experimentais; as barras de erro representam os lotes do SEM. (D) ponto que representa a área sob a distribuição da curva para controle e condições mutantes. Experimental é replicada para ambas as condições de RNAi e controle tefu é exibidas como pontos de dados individuais (em preto) com medianas (linha vermelha). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figura 4: Onipresente tefu knockdown moscas mostram uma capacidade significativamente diminuída de deixar a plataforma. Os dados representam a porcentagem de moscas na plataforma ao longo do tempo (s) para o controle (w–; Actin-Gal4/+) e tefu RNAi (w–; Actin-Gal4/GD11950) voa. (número de repetições = 5; as barras de erro representam o SEM). (A) dados brutos obtidos com a macro"Drosophila ilha ensaio". (B) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para as condições de controle e tefu RNAi, obtidos com a macro"Drosophila ilha ensaio" (Welch não emparelhadas, teste-t * * p &#60; 0,01). (C) dados brutos obtidos contando manualmente o número de moscas presentes na ilha por segundo. (D) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para controle e Tefu RNAi condições obtidas por contagem manual (Welch não emparelhadas, teste-t * * p &#60; 0,01). As barras de erro representam o SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome da coluna</td>
			<td colspan="3">Descrição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatia</td>
			<td colspan="3">Nome do frame.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contagem</td>
			<td colspan="3">O número de objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Área total</td>
			<td colspan="3">Área total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamanho médio</td>
			<td colspan="3">Área total dos objetos detectados no quadro dividido pelo número de objetos dentro dos limites da plataforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% De área</td>
			<td colspan="3">A porcentagem de área ocupada pelos objetos em relação a área total da plataforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Perímetro total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. tamanho de voar</td>
			<td colspan="3">O mínimo voar a configuração de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio" (em pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Área de ROI</td>
			<td colspan="3">A área da plataforma (ROI) definida pelo usuário durante a execução da macro sub definir plataforma (em pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de moscas</td>
			<td colspan="3">O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio".</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parâmetros medidos pela macro"Drosophila ilha ensaio". Os parâmetros descritos na tabela aparecerá no arquivo "Results" ao executar a macro"Drosophila ilha ensaio".
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome da coluna</td>
			<td colspan="3">Descrição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatia</td>
			<td colspan="3">Número do quadro.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contagem</td>
			<td colspan="3">O número de moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Área total das moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. tamanho de voar</td>
			<td colspan="3">O mínimo voar a configuração de entrada de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio" (em pixels).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Área de ROI</td>
			<td colspan="3">A área da plataforma (ROI, em pixels) definida pelo usuário quando executar a macro sub "definir a plataforma".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Número de moscas</td>
			<td colspan="3">O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio".</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% voa presentes na plataforma no respectivo fatia/quadro relativo para o maior número de moscas detectado na plataforma durante o experimento.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commit</td>
			<td colspan="3">Ponto do tempo 1 representa o primeiro quadro a ser analisado e corresponde ao quadro onde as moscas aparecem pela primeira vez na plataforma. Há um total de 100 frames por replicar analisados (correspondente a 10 s, quando usando as configurações descritas.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimento</td>
			<td colspan="3">Número de repetições por condição.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condição</td>
			<td colspan="3">Indica o nome da condição experimental (de acordo com o nome definido pelo usuário da pasta que contém os dados).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Descrição das variáveis obtidas após o processamento dos dados com o roteiro de "Ilha do ensaio análise" Os parâmetros descritos nesta tabela aparecem no arquivo "data_all_conditions.csv" após o processamento dos dados com o roteiro de "Análise do ensaio de ilha".

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High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

O ensaio da ilha é um ensaio relativamente novo e econômico que pode ser usado para avaliar o comportamento locomotor básico de Drosophila melanogaster. Este manuscrito descreve algoritmos para processamento automático de dados e quantificação objetiva dos dados de ensaio de ilha, dificultando a ensaiar uma leitura sensível, elevado-throughput para telas grandes de genéticas ou farmacológicas.

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