Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

Vi erkänner Vienna Drosophila Resource Center och Bloomington Drosophila lager center (NIH P40OD018537) för att tillhandahålla Drosophila stammar. Vi är tacksamma till Klämbt laboratoriet för att införa oss till ön analysen och Martijn Eidhof för att bygga den ön assay setup. Denna studie var delvis stöds av det E-sällsynta-3 gemensamma transnationella ringer bevilja ”förbereda terapier för autosomal recessiv ataxias” Förbered (NWO 9003037604), av ett TOP bidrag (912-12-109) från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), och av två DCN/Radboud University Medical Center PhD fellowships. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Det här protokollet beskriver makrot ”Drosophila ön Assay”, som kvantitativt bedömer Drosophila motoriska beteende under ön analysen. Makrot räknar exakt flugorna på plattformen över tid, vilket gör ön analysen mycket känsliga och lämpar sig för kvantitativa hög genomströmning utvärdering av rörelseapparaten defekter. Metoden möjliggör jämförelse av alla tillstånd, med flugor som odlas under olika genetiska och/eller miljömässiga förhållanden, inklusive läkemedelsexponering. Denna avläsning är således särskilt användbar som upptäckt verktyg när du utför stora genetiska eller farmaceutiska skärmar, när man studerar Drosophila modeller av rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar eller vid prövningen av förflyttning eller flyg beteende.
Protokollet ön analys presenteras i detta manuskript har fördelar jämfört med befintliga/alternativa metoder. Video-tracking locomotion är exempelvis mycket mer tidskrävande och mindre lämplig för att testa stora urvalsstorlekar. Ön analysen är en high-throughput screeningverktyg, och i denna mening, är jämförbar med den snabba interaktiva negativa geotaxis (RING) assay16. Skillnaden mellan två är att ön analyserna möjliggör upptäckt av ett bredare spektrum av rörelseapparaten problem; flugor oförmåga att lämna plattformen kan orsakas av defekter i flykt, hoppning, eller promenader beteende orsakas av wing (muskel/neuronala) och/eller ben (muskel/neuronala) defekter. Däremot, bedömer RING analysen defekter i klättring/vandring beteende orsakas av benet (muskel/neuronala) defekter. Om användare är intresserad av flera behavioral utläsningar, kan ön analysen också lätt kombineras med andra analyser, såsom RING analysen. Dessutom lasrar krävs för optogenetik kan enkelt installeras i rutan ön assay, och installationen är så enkel att den enkelt kan flyttas till ett rum där temperatur och ljus kan kontrolleras.
För att säkerställa framgång och reproducerbarhet av ön analysen beskrivs här, bör flera rekommendationer följas. Delprov och överföring flugorna på experimental prov injektionsflaskor på minst en dag innan experimentet att undvika effekterna av CO2 eller kalla anestesi. Inte överbefolka de experimentella injektionsflaskorna (Använd 10-15 flugor per injektionsflaska, är det bäst att placera alltid samma antal flugor per injektionsflaska). Hålla flugorna på färsk mat hela tiden. Om inte ännu bekant med genomför analysen, praktiken kasta flyger in på plattformen för att maximera avkastningen. Även öva snabbt Upprullningskraften handen rätt efteråt, eftersom det stör dataanalys (bildanalys och flyga räknar start först efter handen är ute ur bilden). Hålla de miljömässiga och experimentella förhållandena identiska i experiment som behöver jämföras (t.ex. kontroller kontra mutanter eller en genotyp testad vid olika åldrar). Alltid utföra experimenten vid samma tid på dagen och underhålla injektionsflaskorna under kontrollerad temperatur och luftfuktighet. För statistisk power, testa minst tre tekniska replikat per biologiska replikat.
Att säkerställa att framgångsrika på det makro som beskrivs här, Webbkamera och bildinställningarna måste justeras för att uppnå maximal kontrast: flugor som visas som svarta objekt på en vit plattform. När antalet flugor inte räknas korrekt av makrot, justera kontrastinställningarna för, om ROI är ordentligt markerad och säkerställa att storleken på flugorna på plattformen är ovan angivna minsta flyga storlek inställning (se steg 8,3 i detta protokoll). Inställningarna behöver bara definieras en gång. De är tillämpliga på alla experiment, så länge som avståndet mellan webbkameran och plattformen inte ändras. Den Circularity_min och max inställningar definierar loopkontroll av partiklarna (partiklar = räknade flugor) som kommer att beaktas för analys (flyger = räknade objekt). 1 representerar en perfekt cirkel och 0 representerar en linje17. Eftersom flugorna medför alltid en viss grad av rörlighet i båda riktningarna (en fluga inte kan visas som en rak linje), den ”Circularity_max”-inställningen är inställd på 1 och inställningen ”Circularity_min” är inställd på 0,4. Det är osannolikt att användaren behöver justera dessa inställningar.
Makrot gör ibland räkna misstag när en fluga ligger nära gränsen till plattformen. Detta kan inträffa om flugor inte kan flyga men promenad och ur den användardefinierade ROI. I de flesta fall kan fÃ¶rnyad markering ROI (montering det så mycket som möjligt till plattformen) enkelt lösa problemet. Dock ”ön Assay analys” skriptet är kan upptäcka och rätta felaktig data räknar orsakas av flugor som går in och ut ur ROI relativt väl. Även om resolutionen av den webbkamera som presenteras här är tillräckligt hög för att diskriminera flugor i närheten ganska väl, vi har infört ytterligare algoritmer i förfarandet bild bearbetning av ”Drosophila ön Assay” makrot, såsom den vattendelare och urholka funktion17. Dessa underlättar korrekt avgränsningen av flugor som finns i närheten på plattformen. Makrot är dessutom inte kan skilja mellan flugor som hoppade från plattformen eller flög bort från den. Det är dock allmänt observerats att friska unga flyga stammar flyga bort omedelbart när släpps på plattformen, medan äldre flugor och flugor med rörelseapparaten underskott finns kvar längre på plattformen, och kommer så småningom hoppa eller falla av plattformen. Trots dessa begränsningar ger den analys och analys ett mycket exakt mått på rörelseapparaten beteende.
För att säkerställa lyckade utförandet av skriptet ”ön Assay analys”, har användaren att se till att ange rätt sökvägar för input och output filer i skriptet rader anges i protokollet och tillhandahålla data i formatet rätt mapp (som anges i figur 2). Om användaren finner de kriterier som används för att filtrera ut opålitliga experimentella data för stränga (rad 68: det första värdet i kolumnen ”räknas” är mindre än eller lika med 5; rad 71: det första värdet i kolumnen ”antal” är högre än det totala antalet flugor kastas på plat RM + 3), Stäng av dessa filterinställningar genom att lägga till en # framför texten i rader 68 och 71 i skriptet ”ön Assay analys”. I detta fall inkluderas alla datamängder i analysen. Alternativt kan filterinställningarna ändras genom att justera värdena i raderna 68 och 71 enligt användarnas behov. Möjliga artefakter i räknas värdena i den ”resultat.txt” genereras av makrot ”Drosophila ön Assay” kan också justeras manuellt, och skriptet kan köras igen på justerade data. När användaren är intresserad bearbetning mer än 10 fps, eller mer än 10 s data, antalet ramar som bearbetas av skriptet ”ön Assay analys” börjusteras. Den statistiska analysen kan också ersättas av användardefinierade alternativ.
En mapp som heter ”exempel på ön Assay”, som innehåller exempel med bild tidsserier erhålls med ön analys, kan hittas på följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Ladda ner mappen ”exempel på ön Assay” och följ stegen som beskrivs i detta protokoll för att snabbt bli förtrogna med strukturera av fillagring, bearbetning av bilder med makrot ”Drosophila ön assay”, och ”ön Assay analys” skriptet.
Ön analysen, kan i kombination med den utvecklade makro och analys script, användas för att utvärdera och kvantifiera avvikande rörelse beteendet hos en Drosophila modell av ataxi-telangiektasi. Eftersom analysen kan tillämpas effektivt på olika åldrar, är det väl lämpad att analysera potentiellt progressiva natur av fenotyper.
Sammanfattningsvis är ön analysen, i kombination med makrot ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” skriptet, en kostnadseffektiv, tillförlitlig och mycket effektiv analys att objektivt analysera och kvantifiera rörelseapparaten defekter i Drosophila modeller av rörelsestörningar på ett sätt som hög genomströmning.

Under de senaste åren har framsteg inom nästa generations sekvensering teknik i hög grad bidragit till identifiering av gener bakom degenerativa rörelsestörningar av hjärnan (t.ex., cerebellär ataxi och Parkinson), av perifer neuronala ursprung (t.ex. amyotrofisk lateralskleros och hereditär spastisk paraplegi), och av muskulär ursprung (t.ex. Duchennes muskeldystrofi och internationellt dystrofi)1,2,3,4 . Trots detta är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom de flesta av dessa sjukdomar. En bättre förståelse av dessa mekanismer är viktigt att utveckla terapier.
Som hos människor styrs rörelse i modellorganismer, såsom flyg och förflyttning i Drosophila, av centrala hjärnan, perifera nervsystemet och musklerna. Dessutom gör snabb generationstid och genetiska uppsättning Drosophila denna modellorganism särskilt lämplig för high-throughput screening av gener involverade i rörelsestörningar och för drogtester5,6 . På grund av det betydande antalet villkor som måste testas i sådana skärmar, pålitlig, kostnadseffektiv, och relativt enkla analyser, samt verktyg för att kvantifiera produktionen resultaten på ett automatiserat sätt, är mycket önskvärda.
Schmidt m.fl. (2012) 7 beskrivs en låg kostnad test som kallas ”ön analysen” att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. Ön analysen har använts framgångsrikt i storskaliga filmvisningar för att identifiera gener med glia-specifika funktioner7, i utvärderingen av Drosophila modeller av utvecklingsstörning8och för den allmänna utvärderingen av flyga motor beteende9. Principen om utformningen av ön analysen består av en förhöjd plattform där flera flugor kastas. Detta framkallar en medfödd motoriska beteende som gör att friska flugor att fly från plattformen inom sekunder. Analysen mäter antalet flugor kvar på plattformen över tid7,8,9. Alla dessa funktioner visar att ön analysen kan vara ett kraftfullt screeningverktyg för genernas rörelsestörningar.
För närvarande, görs kvantitativ analys av filmade ön assay data manuellt7,8,9. För att förbättra effektiviteten i analysen, utvecklades en billig metod för att kvantifiera halvautomatiskt flykten av flugor från plattformen. Inställningen använder en enkel webbkamera ansluten till en bärbar dator att samla in bild, tid serie av plattformen, med ramar förvärvade varje 0,1 s. bildrutorna behandlas sedan med makrot ”Drosophila ön Assay” som kvantifierar antalet flugor på plattform över tid. Makrot ”Drosophila ön Assay” är uppdelad i tre oberoende sub makron: (I) ”skapa stack och projektion”, sub makro identifierar olika island experiment lagras i olika undermappar och skapar en stack och en projektion av varje tidsserier. (II) ”definiera plattform” sub makro öppnas konsekutivt alla ”Projection_image_name.tif”-filer som finns i enskilda experimentella undermappar, vid vilken punkt ombeds användaren manuellt definiera ön plattformen som regionen av intresse (ROI). (III) ”analys” kvantifierar automatiskt antalet flugor kvar på plattformen under tidsserierna. Sub makron kan köras efter varandra (i en kör) eller självständigt. För statistisk dataanalys utvecklades ett skript automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och tillämpa ett statistiskt test för att avgöra om behandlingar/genotyper beter sig signifikant från varandra (figur 1). Slutligen, är det visat att denna inställning kan användas för att utvärdera och kvantifiera en Drosophila modell för ataxi-telangiektasi (AT) avvikande motorisk förmåga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Framsteg i nästa generations sekvensering teknik bidra till identifieringen av sjukdomsgener (kandidat) för rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar med ökande hastighet. Men är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa sjukdomar. Genetiska, molekylär och beteendemässiga verktygslådan för Drosophila melanogaster gör denna modellorganism särskilt användbart att karaktärisera nya sjukdomsgener och mekanismer på ett sätt som hög genomströmning. Dock kräver hög genomströmning skärmar effektiva och tillförlitliga analyser som helst är kostnadseffektiva och möjliggöra automatiserade kvantifiering av drag relevanta för dessa sjukdomar. Den ön-analysen är ett kostnadseffektivt och enkelt set-up metod att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. I denna analys kastas flugor på en plattform från en fast höjd. Detta framkallar en medfödd motoriska respons som gör flugorna till fly från plattformen inom sekunder. För närvarande görs kvantitativa analyser av filmade ön analyser manuellt, vilket är ett mödosamt företag, särskilt när du utför stora skärmar.
Detta manuskript beskriver ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” algoritmer för hög genomströmning, automatisk databehandling och kvantifiering av ön assay data. I setup samlar en enkel webbkamera ansluten till en laptop en bild serie av plattformen medan analysen utförs. ”Drosophila ön Assay” algoritmen utvecklades för programvaran öppen källkod Fiji bearbetar dessa bild-serier och kvantifierar, för varje experimentella villkor, antalet flugor på plattform över tid. ”Ön Assay analys” skriptet, förenlig med den fria programvaran R, utvecklades till automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och för att beräkna om behandlingar/genotyper skiljer sig statistiskt. Detta kraftigt förbättrar effektiviteten i ön analysen och gör det en kraftfull avläsning för grundläggande locomotion och flykt beteende. Det kan således tillämpas på stora skärmar undersöker flyga motorisk förmåga, Drosophila modeller av rörelsestörningar och läkemedlet effekt.

I protokollet beskrivs, Drosophila ön assay data förvärvas och bearbetas i tre steg. Det första flyg flykt svar Drosophila kastas på ön plattformen registreras med en webbkamera och lagras som enskilda .bmp bilder (protokoll avsnitt 1-7). Det andra bearbetar makrot ”Drosophila ön Assay” (steg 8) de ramar, genererar en ”result.txt” textfil (tabell 1), där summeras antalet objekt som upptäcks i varje bildruta, och en bildstapel ”Result_stack.tiff”, som visar de objekt som upptäcks inom plattformen i varje bildruta. Det tredje bearbetar skriptet ”ön Assay analys” (avsnitt 9 protocol) de makrodata som lagras i filerna ”resultat.txt” individuella experiment. Flera steg införlivas i skriptet att filtrera och kombinera data för statistisk analys. Den första bildrutan där flugorna kastas på plattformen upptäcks och anses som tidpunkt 1. Tidigare ramar elimineras från datamängden. 100 bildrutor efter tid punkt 1 (motsvarande 10 s) väljs för analys. Experiment där det ursprungliga antalet flugor upptäcks på plattformen är mindre än 5 är automatiskt undantagna från analysen, eliminera otillförlitliga resultat från underpowered experiment. Experiment där det ursprungliga antalet flugor upptäcks på plattformen överskrider inställningen ”antal flugor per injektionsflaska” plus en tolerans på 3 undantas också. Detta eliminerar datauppsättningar där buller identifierades felaktigt partiklar som flugor. Skriptet beräknar sedan andelen flugor upptäckts för varje tidpunkt jämfört med det högsta antalet flugor som upptäckts i serien. Fel i datamängder som orsakas av flugor som går in och ut ur ROI (upptäcks som en minskning följt av en ökning av andelen flugor på plattform över tid) rättas automatiskt av om dem som ständigt närvarande på plattformen i tidigare skeden . Alla replikera datamängder för ett visst experimentella villkor som var närvarande i huvudkatalogen kombineras och exporteras till filen ”data_all_conditions.csv”. Dess kolumnerna representerar de variabler som beskrivs i tabell 2. Skriptet kommer också exportera ett linjediagram för varje experimentella villkor, namnges enligt den mapp som innehåller data. Denna graf visar procent av flugor kvar på plattformen över tiden (flykt escape svar) för den experimentella replikerar finns i mappen respektive ()figur 3A-B). Det menar, SD, och SEM för varje experimentella villkor beräknas och summeras i filen ”statistik summary.csv”. Ett linjediagram som kallas ”Escape_response_all_conditions.tiff” visar den genomsnittliga flykt escape Svaren för upp till 12 experimentella villkor i huvudmappen ()figur 3 c). Slutligen, arean under kurvan för alla experimentella förhållanden i huvudmappen beräknas och summeras i filen ”AUC.csv”. Beroende på antalet villkor i huvudmappen, kommer skriptet antingen utföra ett tvåsidiga oparade Welch t-test (2 villkor) eller en ANOVA med Tukey korrigering för flera test (mer än 2 villkor) för att avgöra huruvida de experimentella förutsättningarna skiljer sig avsevärt från varandra. Dessa resultat sammanfattas i ”Welch_t-test_results.txt” eller ”AUC_anova_results.txt”. När du utför ANOVA, kommer skriptet också exportera en ”AUC_anova.tiff”-fil som visar skillnaden i genomsnittlig AUC och 95% konfidensintervallen de experimentella betingelser som jämförs. Värdena för absoluta arean under kurvan för de experimentella replikat för alla experimentella förhållanden visas som enskilda datapunkter med medianer i ”AUC.tiff” (figur 3D).
Ataxia Telangiectasia (AT) är en autosomalt recessiv rörelse sjukdom som kännetecknas av tidig debut av cerebellär ataxi på grund av mutationer i genen Ataxia Telangiectasia muterat (ATM)14. Mutanter av den Drosophila orthologue av ATM, tefu, Visa defekter i rörlighet och livslängd15. Utvärdera makrot ”Drosophila ön Assay”, en Drosophila modell at testades i ön analys och data utdata för makrot var jämfört med manuell data räknar. Resultaten visar att allestädes närvarande tefu knockdown (w-, Actin-Gal4/GD11950) avsevärt minskar möjligheten för dessa flugor att lämna plattformen jämfört med deras genetiska bakgrund kontroller (w-, Actin-Gal4/+) ()figur 4). Efter 1 s, 50% av kontroll flugorna hade undgått plattformen, i kontrast till den &#60; 1% av tefu- RNAi flugor. Allt data som erhållits med makrot troget återges uppgifter som erhållits av manuell räknar, som anger att makrot är ett pålitligt verktyg som kan användas för kvantifiering av ön assay data och utvärdering av rörelse fel ( ) Figur 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Figur 1: flödesschema beskriver de krav, experimentell förfarande och analys av ön analysens. (A) ö assay utrustning. (B) experiment för ön analysen. (C) ön assay. (D) behandlingen av ön assay uppgifter med makrot ”Drosophila ön Assay”. Makrot ”Drosophila ön Assay” består av 3 sub makron: 1) göra stack och projektion, 2) definiera plattform och 3) analys. (E) bearbetning och statistisk utvärdering av data med hjälp av skriptet ”ön Assay analys”. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Figur 2: exempel på olika justeringar som krävs under protokollet. (A) önskad katalogstruktur i vilken ö assay experiment måste lagras för databehandling och analys. (B) när du justerar inställningarna för video, flugor måste visas svart på en vit bakgrund. (C) bildram utdatafilersom sparats av den bild-inspelning programvara som beskrivs i detta manuskript. (D), gula disposition visar de val av plattform. Lagrade plattform valet i ”ROI Manager” markeras i blått. (E) flugor är representerade som vita prickar under justering av den ”minsta flyga storlek inställningen”. Resultatfönstret visar området Flugornas i pixlar. (F) exempel på en enda inspelade bildram (till vänster) och den motsvarande ram i den resulterande bilden stack, erhålls med makrot ”Drosophila ön Assay” (på rätten). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Figur 3: resultat bilder erhålls efter databehandling med ”ön Assay analys” script. (A) linje diagram som visar den flykt escape Svaren för varje kontroll experimentella replikera. (B) linje graf visar den flykt escape Svaren för varje tefu RNAi experimentella replikat. (C) genomsnittliga flykt escape svar för angivna experimentella förhållanden; felstaplar representera SEM. (D) Dot tomterna som representerar området under kurvan fördelningen för kontroll och muterade villkor. Experimentell replikat för båda tefu RNAi och kontroll villkor visas som enskilda datapunkter (i svart) med medianer (röda linjen). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Figur 4: Allestädes närvarande tefu knockdown flugor visar en betydligt minskad förmåga att lämna plattformen. Data representerar procenten av flugor på plattformen över tid (s) för kontroll (w-, Actin-Gal4/+) och tefu RNAi (w-, Actin-Gal4/GD11950) flyger. (antal replikat = 5; felstaplar representera SEM). (A) rå data som erhållits med makrot ”Drosophila ön Assay”. (B) Dot tomter som representerar arean under den kurva distributionen för kontroll och tefu RNAi villkor som erhålls med makrot ”Drosophila ön Assay” (Welch oparade t-test, ** p &#60; 0,01). (C) Raw-data som erhållits genom manuellt räkna antalet flugor närvarande på ön per sekund. (D) Dot tomter som representerar arean under den kurva distributionen för kontroll och Tefu RNAi-villkor som erhålls genom att hand-räkna (Welch oparade t-test, ** p &#60; 0,01). Felstaplar representera SEM. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolumnnamn</td>
			<td colspan="3">Beskrivning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skiva</td>
			<td colspan="3">Ramnamn.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greve</td>
			<td colspan="3">Antalet objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total yta</td>
			<td colspan="3">Total yta på de objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomsnittlig storlek</td>
			<td colspan="3">Total yta på de objekt som upptäcks i ramen dividerat med antalet objekt inom ramen för plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Område</td>
			<td colspan="3">Andelen areal som upptas av objekt med avseende på den totala arealen av plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Totala omkretsen av de objekt som upptäcks i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyga storlek</td>
			<td colspan="3">Minst flyga inställning definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay” (i bildpunkter).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området ROI</td>
			<td colspan="3">Området av plattformen (ROI) definieras av användaren under körningen av makrot sub definiera plattform (i bildpunkter).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antal flugor</td>
			<td colspan="3">Antal flugor som används per experiment som definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay”.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Parametrar mäts av makrot ”Drosophila ön Assay”. De parametrar som beskrivs i den här tabellen visas i filen ”resultat.txt” vid kör makrot ”Drosophila ön Assay”.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kolumnnamn</td>
			<td colspan="3">Beskrivning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skiva</td>
			<td colspan="3">Bildrutenummer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greve</td>
			<td colspan="3">Antal flugor som identifieras i ramen inom ramen för plattformen (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Total yta på de flugor som identifieras i ramen inom ramen för plattformen (ROI) i pixlar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. flyga storlek</td>
			<td colspan="3">Minst flyga posten inställning definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay” (i bildpunkter).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Området ROI</td>
			<td colspan="3">Området av plattformen (ROI, i pixlar) definieras av användaren när du kör makrot sub ”definiera plattform”.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antal flugor</td>
			<td colspan="3">Antal flugor som används per experiment som definieras av användaren i det grafiska gränssnittet av makrot ”Drosophila ön Assay”.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% flyger närvarande på plattformen i respektive segment/ramen i förhållande till det högsta antalet flugor upptäcks på plattformen under experimentet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tidpunkt för</td>
			<td colspan="3">Tidpunkt 1 representerar den första bildrutan som analyseras och motsvarar ramen där flugorna först visas på plattformen. Det finns totalt 100 bildrutor per replikat analyseras (motsvarande 10 s, när de beskrivna inställningarna.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experiment</td>
			<td colspan="3">Antal replikat per tillstånd.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Villkor</td>
			<td colspan="3">Anger namnet på det experimentella villkoret (enligt användardefinierade namnet på mappen som innehåller data).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: Beskrivning av variabler erhålls efter behandling av uppgifterna med ”ön Assay analys” script. De parametrar som beskrivs i den här tabellen visas i filen ”data_all_conditions.csv” vid databehandlingen med skriptet ”ön Assay analys”.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Ön analysen är en relativt ny, kostnadseffektiv analys som kan användas för att utvärdera grundläggande rörelseapparaten beteendet hos Drosophila melanogaster. Detta manuskript beskrivs algoritmer för automatisk databehandling och objektiv kvantifiering av ön test data, vilket gör detta test en känslig, hög genomströmning avläsning för stora genetiska eller farmakologiska skärmar.

Hög genomströmning analys av rörelseapparaten beteende i Drosophila ön analysen

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Enstaka Sensillum Inspelningar i Insekter Drosophila melanogaster Och Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Testmetoder motoriskt, inlärning och minne Brister i Drosophila Modeller för neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studera i hjärnan av Adaptive rörelseapparaten Behavior hos insekter

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder för analys Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly-analys för födosöksbeteende i<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestämning av spontan rörelseaktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Hög genomströmning analys för att undersöka äggläggning preferenser Individuella<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Ett enkelt sätt att mäta förändringar i belöning sökande beteende genom<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kvantificering av Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...