Name: high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

Biz Viyana Drosophila Kaynak Merkezi ve Drosophila suşları sağlamak için Bloomington Drosophila stok Merkezi (NIH P40OD018537) kabul edersiniz. Bize ada tahlil ve Martijn Eidhof Adası tahlil kurulum oluşturmak için tanıtmak için Klämbt laboratuvar için sana şükrediyoruz. Bu çalışma yapıldı bölümünde E-nadir-3 Uluslararası arayıp tarafından desteklenen hibe "terapiler otozomal resesif ataxias için hazırlanıyor" hazırlama (NWO 9003037604), Hollanda organizasyon için bilimsel araştırma (NWO) ve tarafından en iyi hibe (912-12-109) iki DCN/Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi Doktora Bursu. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu iletişim kuralı kantitatif Drosophila motor davranış sırasında ada tahlil değerlendiriyor"Drosophila Adası tahlil" makro açıklar. Makro doğru platform üzerinde sinekler zamanla, son derece hassas ve Lokomotor kusurların nicel yüksek üretilen iş değerlendirme için uygun ada tahlil yapma sayar. Metodoloji uyuşturucu pozlama da dahil olmak üzere farklı genetik ve/veya çevresel koşullar altında yetiştirilen sinekler ile herhangi bir koşulu, karşılaştırma için sağlar. Bu okuma böylece büyük genetik veya ilaç ekranlar, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların okurken gerçekleştirirken veya hareket ya da uçuş incelerken keşif aracı olarak yararlıdır davranış.
Bu el yazması sunulan Adası tahlil iletişim kuralı mevcut/alternatif yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Örneğin, video izleme hareket çok daha zaman alıcı ve örneklerin boyutu büyük test etmek için daha az uygun olacaktır. Ada tahlil yüksek üretilen iş tarama aracı ve bu anlamda hızlı etkileşimli negatif geotaxis (yüzük) tahlil16için karşılaştırılabilir olduğunu. İkisi arasındaki fark Adası deneyleri Lokomotor sorunları geniş bir algılama için sağlanmıştır; sinekler ve yetersizlik platformu terk kusurları uçuşta, Zıplama, neden olabilir veya davranış yürüyüş kanat (kas/nöronal) ve/veya bacak (kas/nöronal) tarafından kaynaklanan kusurlar. Öte yandan, yüzük tahlil kusurları tırmanma/yürüyüş davranış (kas/nöronal) bacak kusurları tarafından neden değerlendiriyor. Kullanıcılar birden fazla davranışsal sonuçlar ilgileniyor musunuz diye, ada tahlil de kolayca RING tahlil gibi diğer deneyleri ile birleştirilebilir. Buna ek olarak, optogenetics için gerekli lazerler Adası tahlil kutusunda kolayca kurulabilir ve belgili tanımlık tertibat o kolayca nerede sıcaklık ve ışık kontrol edilebilir bir oda için hareket edebilir basittir.
Başarı ve tekrarlanabilirlik burada açıklanan Adası testin emin olmak için çeşitli öneriler takip edilmelidir. Aliquot ve transfer deneysel test uçmaktadır sulandırıldığında en az bir gün önce CO2 veya soğuk anestezi etkileri önlemek için deneyin. Deneysel şişeleri kalabalık değil (şişe 10-15 sinekler kullanın; her zaman sinekler aynı sayıda şişe yerleştirmek en iyisi). Taze Gıda sinekler her zaman tutun. Eğer değil henüz tahlil iletken aşina, pratik atma verimi en üst düzeye çıkarmak için bir platform uçar. Aynı zamanda hızlı bir şekilde el geri çeker uygulama ve veri analizi (görüntü analizi ve yalnızca resmin dışında eldir başlangıç saymaya sinek) ile müdahale daha sonra şu. Çevre ve deneysel koşullar aynı karşılaştırılmak üzere gereken deneylerde tutmak (Örneğin, denetimler mutantlar veya bir genotip karşı test farklı yaş). Her zaman günün aynı anda deneyler yapmak ve kontrollü sıcaklık ve nem koşullarında şişeleri korumak. İstatistiksel güç için biyolojik REPLICATE başına en az üç teknik çoğaltır sınama.
Açıklanan makro başarılı performansı elde etmek için burada, web kamerası ve görüntü ayarlarını maksimal kontrast elde etmek için ayarlanması gerekir: siyah beyaz bir platformda nesneleri olarak beliren uçar. Sinekler sayısı düzgün makro tarafından sayılır değildir zaman, kontrast ayarlarını, yatırım Getirisi düzgün seçili olup olmadığını kontrol edin ve platform üzerinde sinekler boyutunu belirtilen en az olduğundan emin olun (bkz. Adım 8.3 Bu protokol) boyutunu ayarlama sinek. Ayarları yalnızca bir kez tanımlanmış olması gerekir. Web kamerası ve platform arasındaki mesafe değişmez sürece tüm deneyler için geçerlidir. Döngüsellik parçacıkların Circularity_min ve max ayarlarını tanımlayın (parçacıklar sayılan sinekler =) analizi için dikkate alınacaktır (uçar sayılan nesneler =). 1 tam bir daire ve bir satır170 gösterir. Sinekler her zaman belirli bir ölçüde (karıncayı düz bir çizgi bulunamaz) circularity mevcut 1'de "Circularity_max" ayarını ayarlayın ve "Circularity_min" ayarı 0,4 ayarlanır. Bu kullanıcının bu ayarları yapmak gereken düşüktür.
Bir sinek platform sınır yakın bulunduktan sonra makro bazen sayım hata yapar. Sinekler güvenli ama buradan girip kullanıcı tanımlı ROI uçamaz oluşabilir. Çoğu durumda, (bu platforma mümkün olduğunca uygun) YG yeniden kolayca bu sorunu çözebilir. Ancak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası tespit edebilmektedir ve doğru yanlış veri sayar içinde ve dışında yatırım Getirisi oldukça iyi yürüme sinekler tarafından neden oldu. Burada sunulan webcam çözünürlüğü sinekler yakın oldukça iyi ayırımcılık için yüksek olsa da, biz diğer algoritmalar"Drosophila Adası tahlil" makro görüntü işleme yordamı gibi hayata geçirdik havza ve işlev17aşındırmak. Bu platform üzerinde birbirine yakın olan sinekler uygun tarif kolaylaştırmak. Ayrıca, makro platformu atladı veya ondan uçtu sinekler arasında ayırt edemiyor. Yine de, bu genellikle sağlıklı genç sinek suşları ise büyük sinek ve sinek Lokomotor açıkları ile platformda daha uzun kalır ve sonunda atlamak veya platformdan düşmek hemen platform üzerine düştü uzaklara uç görülmektedir. Bu sınırlamaları rağmen tahlil ve analiz Lokomotor davranış çok doğru bir ölçü sağlar.
"Island tahlil analiz" komut dosyası başarılı performansı sağlamak için kullanıcının iletişim kuralında belirtilen komut satırında giriş ve çıkış dosyalarının doğru yolu girin ve doğru klasöre biçiminde veri (belirtildiği gibi sağlamak için emin olun gerekir. Şekil 2' de). Kullanıcı güvenilir olmayan deneysel veriler çok sıkı filtre uygulamak için kullanılan ölçüt bulursa (satır 68: "Count" sütunundaki ilk değeri; 5 eşit veya daha az satır 71: sinekler üzerinde platfo atılan toplam sayısı daha yüksek "Sayı" sütununda ilk değerdir RM + 3), 68 ve 71 "Ada tahlil analiz" komut dosyasında satırlardaki metnin önüne # ekleyerek bu filtre ayarları kapat. Bu durumda, tüm veri kümeleri analize dahil. Alternatif olarak, filtre ayarlarını 68 ve kullanıcı ihtiyaçlarına göre 71 satırlardaki değerleri ayarlayarak değiştirebilirsiniz. Olası değerleri say ""Drosophila Adası tahlil"makro tarafından oluşturulan dosyasýna" içinde aktarımında da el ile ayarlanabilir ve komut dosyası yeniden ayarlanan veriler üzerinde çalıştırılabilir. Ne zaman kullanıcı ilgilenen daha--dan 10 kare/sn veya daha--dan 10 işleniyor "Ada tahlil analiz" komut dosyası tarafından işlenen kare sayısı s veri gerekirayarlanabilir. İstatistiksel analiz kullanıcı tanımlı alternatifler tarafından da değiştirilebilir.
"Örnekler Adası tahlil örnekleri içeren görüntü zaman Adası tahlil kullanılarak elde serileri ile" adlı bir klasör-ebilmek bulunmak vasıl ertesi gün website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. "Örnekler Adası tahlil" ─░ndirme ve hızlı bir şekilde dosya depolama, "Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" ile görüntü işleme yapısı ile tanımaya olmak için bu iletişim kurallarını açıklanan adımları izleyin komut dosyası.
Ada tahlil gelişmiş makro ve analiz komut dosyası ile birlikte değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi Drosophila modelinin anormal hareket davranışını ölçmek için kullanılabilir. Tahlil çeşitli yaş için verimli bir şekilde uygulanabilir olduğu, fenotipleri potansiyel olarak ilerici doğa analiz için uygundur.
Özet olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile birlikte Adası tahlil objektif olarak analiz etmek ve Lokomotor kusurlarý ölçmek için düşük maliyetli, güvenilir ve yüksek verimli bir tahlil olduğunu. Drosophila bir yüksek-den geçerek şekilde hareket bozuklukları modelleri.

Son yıllarda, yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler büyük ölçüde dejeneratif hareket bozuklukları beyin (Örneğin, serebellar ataksi ve Parkinson), periferik nöronal, altta yatan genlerin tanımlaması için katkıda bulunmuştur Kaynak (Örneğin, amyotrofik lateral skleroz ve herediter Spastik parapleji) ve kas kökenli (Örneğin, Duchenne kas distrofisi ve miyotonik Distrofi)1,2,3,4 . Buna rağmen bu bozuklukların çoğunun altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Bu mekanizmalar daha iyi anlaşılmasını tedaviler geliştirmek için önemlidir.
İnsanlar olduğu gibi canlılar, uçuş ve Drosophila, hareket gibi hareket orta beyin, periferik sinir sistemi ve kas tarafından kontrol edilir. Ayrıca, hızlı oluşturma süresi Drosophila genetik alet bu model organizma genler ile yüksek-den geçerek taranması için özellikle uygun yapmak ilgili ve hareket bozuklukları ve uyuşturucu testi5,6 için . Böyle ekranlar, güvenilir, uygun maliyetli ve göreli basit deneyleri gibi araçlar otomatik bir şekilde çıktı sonuçları ölçmek için test edilebilir için gereken koşulları önemli sayıda nedeniyle, son derece arzu edilir.
Schmidt vd. (2012) 7 açıklanan "ada tahlil" adında bir düşük maliyetli testiniz Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Ada tahlil başarıyla büyük ölçekli gösterimleri glia özgü işlevleri ile7, Drosophila modelleri Fikri Engellilik8ve genel değerlendirilmesi için değerlendirilmesinde genlerin tanımlamak için kullanılmıştır motor davranış9sinek. Ada tahlil ilke tasarımını yükseltilmiş bir platform üzerine birkaç sinek atılır oluşur. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sağlıklı sinek sağlar doğuştan gelen bir motor davranış neden olmaktadır. Tahlil platformda saat7,8,9üzerinde kalan sinek sayısını ölçer. Tüm bu özellikler Adası tahlil hareket bozuklukları ilgili genler için güçlü tarama aracı olabilir gösterir.
Şu anda, kantitatif analiz filme Adası tahlil verilerin el ile7,8,9yapılır. Tahlil verimliliğini artırmak için yarı otomatik olarak sinekler platform kaçış ölçmek için bir düşük maliyetli yöntem geliştirilmiştir. Kur üzerinde sinekler platformunda sayısı quantifies platformu çerçeveler ile dizi s. çerçeveler sonra"Drosophila Adası tahlil" makro ile işlenen her 0.1 alınan görüntü zaman toplamak için bir dizüstü bilgisayar için bağlı basit bir web kamerası kullanır zaman. "Drosophila Adası tahlil" makro üç bağımsız alt makro ayrılmıştır: (I) ve "Create yığını ve projeksiyon," alt makro farklı alt klasörlerinde depolanan farklı ada deneyler tanımlar ve bir yığın ve her bir projeksiyon oluşturur saat serisi. (II "Platformu Define" alt makro arka arkaya bu noktada el ile ada platformu faiz (ROI) bölgesi olarak tanımlamak için kullanıcı talep deneysel alt klasörleri bireysel içinde bulunan tüm "Projection_image_name.tif" dosyaları açılır. (III) "analiz" otomatik olarak saat serisi sırasında platform üzerinde kalan sinek sayısı quantifies. Art arda (bir çalışma) alt makroları çalıştırabilirsiniz veya bağımsız olarak. İstatistiksel veri analizi için bir komut dosyası otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip önemli ölçüde birbirinden farklı (şekil 1) davranır olup olmadığını belirlemek için bir istatistiksel test uygulamak için geliştirilmiştir. Son olarak, bu kurulum değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi (AT) için bir Drosophila model anormal Lokomotor yeteneği ölçmek için kullanılabilir uygulaması gösterilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler (aday) hastalık genleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların artan bir hızda tanımlaması katkıda bulunur. Ancak, bu bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Drosophila melanogaster genetik, moleküler ve davranışsal araç bu model organizma yeni hastalık genler ve mekanizmaları bir yüksek-den geçerek şekilde karakterize etmek özellikle kullanışlıdır. Yine de, yüksek üretilen iş ekranlar bu, ideal olarak, düşük maliyetli ve özellikleri automatized miktar için bu bozuklukları için ilgili izin verimli ve güvenilir deneyleri gerektirir. Ada tahlil bir maliyet-etkin olduğunu ve kolayca kurulum yöntemi Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Bu tahlil, sinekler bir platform üzerine sabit bir yükseklikten atılır. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sinek sağlar doğuştan gelen bir motor yanıt neden olmaktadır. Şu anda, kantitatif analiz filme Adası deneyleri el ile özellikle büyük ekran gerçekleştirirken zahmetli bir girişim olduğu yapılır.
Bu el yazması"Drosophila Adası tahlil" ve "Ada tahlil analiz" algoritmaları yüksek üretilen iş, otomatik bilgi işlem ve ada tahlil veri miktar için açıklar. Tahlil yapılır iken kurulumunda bir laptop için bağlı basit bir web kamerası bir görüntü serisi platformu toplar. Açık kaynak yazılım Fiji için geliştirilen"Drosophila Adası tahlil" algoritması bu görüntü serisi işler ve quantifies, deneysel her koşul için sinekler zamanla platformda sayısı. R, özgür yazılımla uyumlu "Ada tahlil analiz" komut dosyası, otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip istatistiksel olarak farklı olup hesaplamak için geliştirilmiştir. Bu büyük ölçüde Adası tahlil verimliliğini artırır ve temel hareket ve uçuş davranış için güçlü bir okuma yapar. Böylece sinek Lokomotor yeteneği, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve ilaç etkinliğini araştıran büyük ekranlara uygulanabilir.

Açıklanan protokolünde, Drosophila Adası tahlil verileri alınan ve üç adımda işlenir. İlk olarak, ada platform üzerine atılmış Drosophila uçuş kaçış tepkisi ile bir web kamerası kaydedilir ve bireysel .bmp görüntü (iletişim kuralı bölümleri 1-7) olarak depolanır. İkinci olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro (Adım 8) üreten bir "result.txt" metin dosyası içinde her çerçevede tespit nesne sayısını özetlenen, (tablo 1), çerçeveler ve görüntü yığını "Result_stack.tiff, gösteren" işler Her çerçeve içinde belgili tanımlık peron alanı içinde tespit nesneler. Üçüncü olarak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası (iletişim kuralı Bölüm 9) bireysel deneyler "dosyasýna" dosyalarında saklanan makro verileri işler. Birkaç adım filtre uygulamak ve verileri istatistiksel analiz için birleştirmek için komut dosyasında dahil edilmiştir. Sinekler platformda atılır ilk kare algılanır ve 1 saat noktası kabul. Önceki çerçeve kümesinden ortadan kalkar. 100 çerçeveler zaman aşağıdaki işaretleyin 1 (10'a karşılık gelen s) analiz için seçilir. Tespit sinekler platformunda ilk sayısı 5'ten küçük olan deneyler güvenilmez sonuçlar yeterince güçlü deneyler ortadan kaldırarak analizi, otomatik olarak dışarıda bırakılır. Hangi "Şişe başına sinekler sayısı" ayarı artı tolerans 3 tespit sinekler platformunda ilk sayısını aşıyor deneyler de dışarıda bırakılır. Bu hangi gürültü parçacıklar yanlışlıkla sinekler algılanan veri kümeleri ortadan kaldırır. Komut dosyası daha sonra dizide tespit sinekler en yüksek sayısına göre her zaman için tespit sinekler yüzdesini hesaplar. Veri kümeleri yürüyüş (sinekler yüzdesi bir artış platformda zamanla ardından bir düşüş olarak tespit) YG içinde ve dışında uçar kaynaklanan hataları otomatik olarak tarafından onları ile ilgili olarak sürekli mevcut platform üzerinde daha önceki aşamalarında düzeltilir . Ana dizinde bulunan tüm çoğaltma veri kümeleri belirli bir deneysel koşulu için birleştirilir ve "data_all_conditions.csv" dosyasına dışa. Onun sütunlar Tablo 2' de açıklanan değişkenleri temsil eder. Komut dosyası da bir çizgi grafik verileri içeren klasörü göre adlı deneysel her koşul için dışa aktaracaktır. Bu grafik sinekler olan deneysel (uçuş kaçış yanıt) zamanla platform üzerinde kalan yüzde çoğaltır kendi klasöründe ()şekil 3Amevcut gösterir-B). Ortalama, SD ve SEM deneysel her koşul için hesaplanır ve "İstatistik summary.csv" dosyasında özetlenmiştir. "Escape_response_all_conditions.tiff" adı verilen bir çizgi grafik ortalama uçuş kaçış yanıt ilâ 12 deneysel koşullar ()şekil 3 c)ana klasöründe mevcut gösterir. Son olarak, tüm deneysel koşullar ana klasöründe için eğri altındaki alan hesaplanan ve "AUC.csv" dosyasında özetlenmiştir. Koşullar ana klasöründe sayısına bağlı olarak, komut dosyası ya da bir iki uçlu unpaired Welch t-Testi (2 koşulları) ya da bir ANOVA Tukey düzeltme ile birden çok (2'den fazla koşullar) belirlemek test etmek için gerçekleştirir olup olmadığını deneysel koşullar önemli ölçüde birbirinden farklı. Bu sonuçlar "Welch_t-test_results.txt" veya "AUC_anova_results.txt." özetlenen ANOVA gerçekleştirirken komut dosyası da demek AUC farklılığı ve % 95 güven aralıkları karşılaştırılır deneysel koşullar görüntüler bir "AUC_anova.tiff" dosyası dışa aktaracaktır. Mutlak alan tüm deneysel koşullar için deneysel çoğaltır eğri altındaki değerleri tek tek veri noktalarını medians içinde "AUC.tiff" (şekil 3D) ile görüntülenir.
Ataksi Telanjiektazi (AT) serebellar ataksi ataksi Telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) gen14mutasyonların nedeniyle erken başlangıçlı ile karakterize bir otozomal resesif hareket bozukluğu var. ATM, tefu, Drosophila orthologue mutantlar kusurları hareketlilik ve uzun ömürlü15içinde görüntüler. "Drosophila Adası tahlil" makro değerlendirmek için Drosophila manken at Adası assay olarak test edilmiş ve makro veri çıkışı el ile veri sayıları için karşılaştırıldı. O her yerde tefu sonuç nakavt (w-; Actin-Gal4/GD11950) Bu sinekler (w-; onların genetik arka plan kontrollere göre platformu terk yeteneğini önemli ölçüde azaltır Actin-Gal4/+) ()şekil 4). 1 sonra s, % 50'sini kontrol sinekler kaçtı platformu, aksine &#60; tefu% 1 - RNAi uçar. Önemlisi, sayma, makroyu Adası tahlil veri miktar ve hareket kusurları () değerlendirilmesi için kullanılan güvenilir bir araç olduğunu belirten el kitabı tarafından elde edilen veriler ile makro sadakatle elde edilen veriler çoğaltılamaz Şekil 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Şekil 1: gereksinimleri, deneysel bir işlem ve analiz Adası testin özetleyen akış çizelgesi. (A)Adası donanımları assay. (B) Adası tahlil için deneysel Kur. (C) Adası tahlil. (D)"Drosophila Adası tahlil" makro ile ada tahlil verilerin işlenmesi. "Drosophila Adası tahlil" makro 3 alt makroları oluşmaktadır: 1) yığını ve projeksiyon yapmak, 2) tanımlamak platformu ve 3) analizi. (E) işleme ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası kullanarak verilerin istatistiksel değerlendirme. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Şekil 2: farklı ayarlar iletişim kuralı sırasında gerekli örnekleri. (A) gerekli dizin yapısı hangi Island'da, veri işleme ve analiz için tahlil deneyler depolanmalıdır. (Sinekler görünmesi gerekir video ayarlarını ayarlarkenB) siyah beyaz bir arka plan üzerinde. (C) resim çerçevesi çıktı dosyalarıBu el yazması açıklanan görüntü kayıt yazılımı tarafından kaydedilmiş gibi. (D) sarı anahat platform seçimi gösterir. Saklı platformu seçim "ROI Yöneticisi'nde" mavi renkle vurgulanır. (E) sinekler "en az sinek boyutu ayarını." ayarından sırasında beyaz noktalar gösterilir Sonuçları penceresinde alan "Sineklerin Tanrısı" piksel olarak gösterir. (F) bir tek kaydedilmiş resim çerçevesi (solda) ve"Drosophila Adası tahlil" makro (sağda) ile elde edilen sonuç Görüntü yığınındaki karşılık gelen çerçeve örneği. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Şekil 3: sonuç görüntüleri elde edilen veri işleme "Ada tahlil analiz" filmi ile sonra (A)satırının her biri için uçuş kaçış tepki gösteren grafik kontrol deneysel çoğaltılır. (B) hattı uçuş kaçış yanıt için her tefu RNAi deneysel REPLICATE gösteren grafik. (C) ortalama uçuş kaçış yanıt belirtilen deneysel koşullar için; hata çubukları denetim ve mutant koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden SEM (D) nokta araziler temsil eder. Deneysel çoğaltır koşulların her ikisi de tefu RNAi ve kontrol için tek tek veri noktaları (siyah) olarak medians (kırmızı çizgi) ile görüntülenir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Şekil 4: Her yerde tefu devirme sinekler platformu bırakmak önemli ölçüde azalma yeteneği gösterir. Zaman (s) için denetim (w-; içinde sinekler platformunda yüzde verileri temsil Actin-Gal4/+) ve tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) uçar. (çoğaltır sayısı = 5; hata çubukları SEM temsil eder). "Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen(a)ham veri. (B) nokta çizer"Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen denetim ve tefu RNAi koşulları için eğri dağıtım alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p &#60; 0,01). (C) ham veri elle sayılması tarafından elde edilen mevcut saniyede adada uçar. (D) nokta çizer denetim ve el-sayılarak elde Tefu RNAi koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p &#60; 0,01). Hata çubukları SEM temsil <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sütun adı</td>
			<td colspan="3">Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilim</td>
			<td colspan="3">Çerçeve adı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam alan</td>
			<td colspan="3">Piksel cinsinden platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin toplam alan.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortalama boyutu</td>
			<td colspan="3">Toplam alan platformu (ROI) sınırları içinde nesneleri sayısı bölü çerçevesinde tespit nesneler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Alanı</td>
			<td colspan="3">Alan Toplam alan (ROI) platformu ile ilgili nesneler tarafından işgal yüzdesi.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Toplam çevre platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit nesneler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. sinek boyutu</td>
			<td colspan="3">En azından uçmak"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu ayarı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alan yatırım Getirisi</td>
			<td colspan="3">Alt makro Çalıştır sırasında kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (ROI) alanını tanımlamak platformu (piksel cinsinden).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinekler sayısı</td>
			<td colspan="3">"Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1:"Drosophila Adası tahlil" makro tarafından ölçülen parametreler. Bu tabloda açıklanan parametreleri"Drosophila Adası tahlil" makro çalıştıran üzerine "sonuç.txt" dosyasında görünür.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sütun adı</td>
			<td colspan="3">Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilim</td>
			<td colspan="3">Çerçeve numarası.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Sinekler platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Toplam alan platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit Sineklerin Tanrısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. sinek boyutu</td>
			<td colspan="3">En azından"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu giriş ayarı sinek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alan yatırım Getirisi</td>
			<td colspan="3">Alt makro çalıştıran "tanımladığınızda platformu" kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (YG, piksel) alanı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinekler sayısı</td>
			<td colspan="3">"Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% platformu çerçevesinde ilgili dilim/platform üzerinde deneme sırasında tespit sinekler en yüksek sayısına oranla mevcut uçar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">Zaman noktası 1 analiz edilecek ilk kareyi temsil eder ve sinekler platformda ilk görüntülendiği çerçevenin karşılık gelir. Var a toplam 100 kare / analiz çoğaltılır (10'a karşılık gelen açıklanan ayarlarını kullanırken s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deney</td>
			<td colspan="3">Koşul başına çoğaltır sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koşul</td>
			<td colspan="3">Deneysel durumuna (göre verileri içeren klasörü kullanıcı tarafından tanımlanan adı) adını gösterir.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: değişkenleri açıklaması elde edilen veri "Ada tahlil analiz" filmi ile işledikten sonra Bu tabloda açıklanan parametreleri "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile veri işleme üzerine "data_all_conditions.csv" dosyasında görünür.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Böcekler Adaptif Lokomotor Davranış Sinir Dayanak incelenmesi

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...