Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

وأيد هذا العمل في جزء من معهد بحوث فان أندل ومنحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (CA181343) ل سبر

1. تثبيت وتشغيل أرينينيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت أوراكل صندوق الظاهري من www.virtualbox.org. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وفك ضغط الجهاز الظاهري أرينينيا (فم) من http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مربع الظاهري وإض?...

موثوقية الأجسام المضادة في تطبيقات البحوث الطبية الحيوية أمر بالغ الأهمية 46 ، 47 . هذا صحيح بشكل خاص في الكيمياء الحيوية لونين نظرا لموقف الأجسام المضادة كأدوات رئيسية لغالبية التقنيات المتقدمة لتوصيف وفرة وتوزيع هيتمون بتمس. بروتوكو?...

يتم تعبئة الحمض النووي الجيني بشكل أنيق داخل النواة النواة النواة النواة مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين. وحدة فرعية من الكروماتين تكرار هو نوكليوسوم، والذي يتكون من 147 زوجا قاعدة من الحمض النووي ملفوفة حول جوهر أوكتامريك من البروتينات هيستون - H2A، H2B، H3، و H4 1 . وينظم الكروماتين على نطاق واسع في يوكروماتين معبأة فضفاضة ومجالات هيتيروكروماتين معبأة بإحكام. درجة ضغط الكروماتين ينظم المدى الذي يمكن للأجهزة البروتين الوصول إلى الحمض النووي الأساسي لتنفيذ العمليات الأساسية الحمض النووي مثل النسخ المتماثل، والنسخ، وإصلاح. المنظمين الرئيسيين للوصول الجينوم في سياق لونين هي بتمس على الذيل غير المهيكلة والنطاقات الأساسية للبروتينات هيستون 2 ، 3 . هيستون بتمس وظيفة مباشرة من خلال التأثير على بنية لونين 4 وغير مباشر ثروغح تجنيد بروتينات القارئ والمجمعات الجزيئات المرتبطة بها التي لديها إعادة عرض لونين، الأنزيمية، والأنشطة السقالات 5 . دراسات على وظيفة هيستون بتم على مدى العقدين الماضيين تقترح بأغلبية ساحقة هذه العلامات تلعب الأدوار الرئيسية في تنظيم مصير الخلية، والتنمية الكائن الحي، ومرض بدء / التقدم. مدعوم من التقدم في تكنولوجيا الطيف الكتلي المستندة إلى البروتين، تم اكتشاف أكثر من 20 بتمس هيستون فريدة من نوعها على أكثر من 80 مخلفات هيستون متميزة 6 . ومن الجدير بالذكر أن هذه التعديلات غالبا ما تحدث في توليفات، وتمشيا مع فرضية &quot;هيستون كود&quot;، العديد من الدراسات تشير إلى أن البروتينات القارئ تستهدف مناطق منفصلة من الكروماتين من خلال الاعتراف مجموعات محددة من هيستون بتمس 7 ، 8 ، 9 . والتحدي الرئيسي الذي سيتحرك إلى الأمام هو تعيين وظائف إلى غربسبب قائمة هيتمون بتمس وتحديد كيفية تركيبات محددة من هيستون بتمس أوركسترات وظائف ديناميكية المرتبطة بالكروماتين. الأجسام المضادة هي الكواشف لينكبين للكشف عن هيستون بتمس. وعلى هذا النحو، فقد تم تطوير أكثر من 1000 هيستون من الأجسام المضادة المتمثلة في هيتمون تجاريا لاستخدامها في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. مع التطور السريع لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية، وتستخدم هذه الكواشف على نطاق واسع من قبل المحققين الفردية وعلى نطاق واسع إبيجنوميكس &quot;خارطة الطريق&quot; المبادرات (على سبيل المثال ، إنكود و بوبرينت) في تشيب-سيق (الكروماتين مناعي إلى جانب الجيل القادم التسلسل ) لتوليد خرائط المكانية عالية الدقة لتوزيع هيستون بتم على نطاق الجينوم 10 ، 11 . ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم يمكن أن تكون متغيرة للغاية، وأن هذه الكواشف تظهر غير صالحة<html> ( مثل ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميليليسين) 12 و 13 و 14 و 15 ، 16 ، 17 ، 18 . لذلك، مراقبة الجودة الصارمة من هيستون بتم-الكواشف الأجسام المضادة محددة ضروري لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها بدقة مع هذه الكواشف القيمة. تكنولوجيا ميكروأري تمكن الاستجواب في وقت واحد من الآلاف من التفاعلات الجزيئية في إنتاجية عالية، استنساخه، وتصغيرها الشكل. لهذا السبب، تم إنشاء مجموعة متنوعة من منصات ميكروأري لتحليل البروتين الحمض النووي 19 ،&quot;&gt; 20 والبروتينات البروتين 21 ، والتفاعلات الببتيد البروتين 22. في الواقع، وقد ظهرت ميكروأرس الببتيد هيستون كمنصة اكتشاف بالمعلومات للبحوث الكيمياء الحيوية لونين، مما يتيح التنميط الإنتاجية العالية للكتاب، محايات، وقراء هيستون بتمس 15 ، 23 ، 24 ، وأيضا لتحليل هيستون خصوصية الأجسام المضادة 17 ، 25. أبعد من تطبيقها في الكروماتين والبحوث علم الوراثة، صفائف الببتيد هيستون لها فائدة محتملة كاختبار التشخيص / النذير لذئبة الحمامية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية الأخرى حيث المضادة للالتهابات، يتم إنشاء الأجسام المضادة لونين 26 ، 27 . هنا، نحن تصف خط أنابيب المتكاملة التي وضعناها لتصميم، تلفيق، و كيوريجين هيبتون ميكروأرس هيستون لتوليد ملامح خصوصية للأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس و بتمس بهم. ويسهل خط الأنابيب من قبل أرينينيا، مفتوح المصدر، وتطبيق البرمجيات التفاعلية التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . تعمل أرينينيا بشكل أفضل في غوغل كروم. باختصار، يتم استخدام طابعة ميكروأري الاتصال الروبوتية لإيداع مكتبة من البيوتين هيتون الببتيدات مترافق البيوتين في مواقف محددة على شرائح المجهر الزجاج ستريبتافيدين المغلفة. صفائف يمكن بعد ذلك أن تستخدم في شكل مقايسة تنافسية ومتوازية لاستجواب التفاعلات الأجسام المضادة-حاتمة ( الشكل 1 ). تتكون مكتبة الببتيد من مئات من الببتيدات الاصطناعية الفريدة التي تؤوي بتمس (ليسين أسيتيلاتيون، ليسين / أرجينين مثيلة، و سيرين / ثريونين فسفوريلاتيون) وحدها وفي توليفات ذات صلة مستمدة إلى حد كبير من مجموعات بروتيوميكس. طرق لتوليف الببتيد والتحقق من صحة<html> مفصلة في مكان آخر 23 . يتم تخزين البيانات التي تم إنشاؤها من جهودنا الحالية هيستون بتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام هذه المنصة مجموعة على الموارد على شبكة الإنترنت العامة، وهيستون هيتيون الأجسام المضادة قاعدة بيانات (www.histoneantibodies.com). ومن الجدير بالذكر أن هيستون الببتيد ميكروأرس ملفقة مع الاختلافات من هذا البروتوكول كما استخدمت على نطاق واسع لتوصيف نشاط هيستون بتم القارئ المجالات 8 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ومؤخرا إلى ملف هيستون بتم الكاتب و الممحاة الأنشطة 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: رسم كاريكاتوري من الإجراء تدريجي لفحص الأجسام المضادة على هيستون الببتيد ميكروأري. الببتيدات هيستون البيروكسيديز الإيواء تعريف التعديلات بعد متعدية (الدوائر الحمراء والزرقاء) هي شارك في طباعة مع البيوتين فلوريسئين على الزجاج المغلفة ستريبتافيدين. يتم تصور التفاعلات الإيجابية كما مضان أحمر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

يتم دراسة التعديلات بعد متعدية (بتمس) على البروتينات هيستون على نطاق واسع لدورها في تنظيم هيكل الكروماتين والتعبير الجيني. وقد سهل الإنتاج الضخم وتوزيع الأجسام المضادة المحددة ل هيستون بتمس إلى حد كبير البحث على هذه العلامات. كما هيستون الأجسام المضادة بتم هي الكواشف الرئيسية للعديد من الكروماتين تطبيقات الكيمياء الحيوية، تحليل دقيق للخصوصية الأجسام المضادة ضروري لتفسير البيانات دقيقة والتقدم المستمر في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام ميكروأرس الببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة هيستون. يتم تسهيل جوانب التصميم والتحليل من هذا الإجراء من قبل أرينينيا، مفتوحة المصدر وتفاعلية حزمة البرامج التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتبسيط تخصيص صيغ الطباعة ميكروأري. وقد استخدمت هذه الأنابيب لفحص عدد كبير من المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع هيستون بتم أنتيبوديs، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال قاعدة بيانات خصوصية هيستون الأجسام المضادة على الانترنت وتوسيعها. ما وراء الهستونات، المنهجية العامة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتحليل الأجسام المضادة بتم محددة.

وقد تم استخدام هذا البروتوكول لتصميم وتصنيع منصة ميكروأري الببتيد لتحليل هيستون بتم الضد خصوصية. الصفيف يستعلم مكتبة من أكثر من 300 ميزات الببتيد فريدة من نوعها (20 - 40 بقايا في الطول) تمثل العديد من مجموعات معروفة من بتمس وجدت على الأساسية والبروتينات...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

عزل هيستون من نسيج أوراق الذرة الرفيعة لقياس الطيف الكتلي العلوي لأسفل من العلامات اللاجينية المحتملة

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة- المستضدات بواسطة القياس الضوئي الشامل

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...