Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

1. Installere og køre ArrayNinja <ol><li> Download og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org. </li><li> Download og komprimer ArrayNinja virtuelle maskine (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Åbn Virtual Box og tilføj ArrayNinja VM ved at klikke på &#39;Maskine&#39;, &#39;Tilføj&#39; og vælg arrayninja.vbox fra den mappe, hvor ArrayNinja VM blev gemt. </li><li> Start ArrayNinja ved at vælge det inde i Virtual Box og klikke på den grønne &quot;start&quot; -pile. </li><li> V...

Antistofens pålidelighed i biomedicinske forskningsapplikationer er afgørende 46 , 47 . Dette gælder især i kromatinbiokemi givet antistoffernes position som nøgleværktøjer til de fleste teknikker, der er udviklet til at karakterisere overfladen og fordelingen af ​​histon-PTM&#39;er. Protokollen præsenterede her detaljer en optimeret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays for at analysere histon PTM antistofspecificitet. ...

Genomisk DNA pakkes elegant inde i den eukaryote cellekerne med histonproteiner til dannelse af chromatin. Den gentagne underenhed af kromatin er nukleosomet, som består af 147 basepar af DNA viklet omkring en octamer kerne af histonproteiner - H2A, H2B, H3, og H4 1. Kromatin er bredt organiseret i løst pakket eukromatin og tæt pakket heterochromatin domæner. Graden af ​​chromatin-komprimering regulerer i hvilket omfang proteinindustrien kan få adgang til det underliggende DNA til at udføre grundlæggende DNA-templaterede processer som replikation, transkription og reparation. Nøgleregulatorer for genometilgængelighed i forbindelse med chromatin er PTM&#39;er på de ustrukturerede hale- og kerneområder af histonproteiner 2 , 3 . Histon-PTM&#39;er virker direkte ved at påvirke strukturen af ​​chromatin 4 og indirekte througH rekruttering af læserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser, der har kromatin remodeling, enzymatisk og stilladsaktiviteter 5 . Undersøgelser af histon-PTM-funktion i løbet af de sidste to årtier tyder på overvejende, at disse mærker spiller nøglerolle i regulering af celleforebyggelse, organisationsudvikling og sygdomsinitiering / progression. Fueled af fremskridt i massespektrometri-baseret proteomteknologi er der fundet mere end 20 unikke histon-PTM&#39;er på mere end 80 forskellige histonrester 6 . Navnlig forekommer disse modifikationer ofte i kombinationer og i overensstemmelse med &quot;histonkode&quot; -hypotesen, viser talrige undersøgelser, at læserproteiner er målrettet mod diskrete regioner af chromatin ved genkendelse af specifikke kombinationer af histon-PTM&#39;er 7 , 8 , 9 . En vigtig udfordring fremadrettet vil være at tildele funktioner til grSkyldige liste over histon-PTM&#39;er og at bestemme, hvordan specifikke kombinationer af histon-PTM&#39;er orkestrerer de dynamiske funktioner, der er forbundet med chromatin. Antistoffer er lynchpinreagenser til påvisning af histon-PTM&#39;er. Som sådan er mere end 1000 histon-PTM-specifikke antistoffer blevet udviklet kommercielt til anvendelse i kromatinbiokemiforskning. Med den hurtige udvikling af DNA-sekventeringsteknologi med høj gennemstrømning anvendes disse reagenser i vid udstrækning af individuelle efterforskere og omfattende epigenomiske &quot;køreplan&quot; -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (chromatinimmunpræcipitation kombineret med næste generations sekventering ) Rørledninger til at generere højopløselige rumlige kort af histon PTM-fordelingsgenet bredt 10 , 11 . Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at specificiteten af ​​histon-PTM-antistoffer kan være meget variabel, og at disse reagenser udviser uegnede<html> Dyrebare egenskaber som off-target-epitopgenkendelse, stærk positiv og negativ indflydelse fra nabo-PTM&#39;er og vanskeligheder med at diskriminere modifikationsordren på en bestemt rest ( fx mono-, di- eller trimethyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontrol af histon PTM-specifikke antistofreagenser nødvendigt for nøjagtigt at fortolke data genereret med disse værdifulde reagenser. Microarray-teknologien muliggør samtidig forespørgsel af tusindvis af makromolekylære interaktioner i et gennemgående, reproducerbart og miniaturiseret format. Af denne årsag er der blevet udviklet en række mikroarrayplatforme til analyse af protein-DNA 19 ,&quot;&gt; 20, proteinprotein 21 og proteinpeptid-interaktioner 22. Faktisk er histonpeptidmikroarrays fremkommet som en informativ opdagelsesplatform for chromatin biokemiforskning, der muliggør højprofilering af forfattere, viskelæder og læsere af histon PTM&#39;er 15 , 23, 24, og også til analyse af histon antistofspecificitet 17, 25. Beyond deres anvendelse i kromatin og epigenetik forskning, histon peptidarrays har potentiel anvendelighed som en diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sygdomme, hvor anti- Chromatin autoantistoffer er dannet 26 , 27 . Her beskriver vi en integreret rørledning, som vi har udviklet til design, fremstilling og køRying histone peptid microarrays at generere specificitet profiler for antistoffer, der genkender histoner og deres PTMs. Rørledningen understøttes af ArrayNinja, en open source, interaktiv software applikation, som vi for nylig udviklede, som integrerer design- og analysestadierne i microarray eksperimenter 28 . ArrayNinja virker bedst i Google Chrome. Kort fortalt anvendes en robotkontakt-mikroarray printer til at deponere et bibliotek af biotinkonjugerede histonpeptider i definerede positioner på streptavidin-coatede glasmikroskop dias. Arrays kan derefter anvendes i et konkurrencedygtigt og parallelt assayformat for at forhøre antistof-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består af hundredvis af unikke syntetiske peptider, der indeholder PTM&#39;er (lysinacetylering, lysin / argininmethylering og serin / threoninphosphorylering) alene og i relevante kombinationer, der stort set er afledt af proteomiske datasæt. Metoder til peptidsyntese og validering<html> Er beskrevet andetsteds 23 . Data genereret fra vores igangværende histone PTM antistof screening indsats udnytter denne array platform er arkiveret på en offentlig web ressource, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Især er histonpeptidmikroarrays fremstillet med variationer af denne protokol også blevet anvendt i vid udstrækning for at karakterisere aktiviteten af ​​histon PTM-læserdomænerne 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mere for nylig til profilering af histon PTM forfatter og viskelæder 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Tegneserieafbildning af den trinvise procedure til antistof screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerede histonpeptider med definerede posttranslationelle modifikationer (røde og blå cirkler) er trykt med biotin-fluorescein på streptavidin-belagt glas. Positive interaktioner visualiseres som rød fluorescens. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Post-translationelle modifikationer (PTM&#39;er) på histonproteiner studeres bredt for deres roller i regulering af kromatinstruktur og genekspression. Masseproduktionen og distributionen af ​​antistoffer, der er specifikke for histon-PTM&#39;er, har i høj grad lettet forskningen på disse mærker. Da histon-PTM-antistoffer er nøglereagenser til mange kromatinbiokemiske applikationer, er streng analyse af antistofspecificitet nødvendig for nøjagtig datatolkning og fortsatte fremskridt på området. Denne protokol beskriver en integreret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays til profilering af specificiteten af ​​histonantistoffer. Design og analyse aspekter af denne procedure er lettet af ArrayNinja, en open source og interaktiv softwarepakke, vi for nylig udviklede for at strømline tilpasningen af ​​microarray printformater. Denne rørledning er blevet brugt til at screene et stort antal kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte histon PTM antibodiesS, og data genereret fra disse eksperimenter er frit tilgængelige via en online og udvidende Histone Antibody Specificity Database. Ud over histoner kan den generelle fremgangsmåde beskrevet heri anvendes bredt til analysen af ​​PTM-specifikke antistoffer.

Denne protokol er blevet anvendt til at designe og fremstille en peptid-mikroarrayplatform til analyse af histon-PTM-antistofspecificitet. Arrayet spørger om et bibliotek med mere end 300 unikke peptidfunktioner (20-40 rester i længden), der repræsenterer mange af de kendte kombinationer af PTM&#39;er, der findes på kerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledning har været en arbejdshest for screeningen af ​​mange almindeligt anvendte og kommercie...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Dette manuskript beskriver metoder til anvendelse af peptidmikraariteknologi til specificitetsprofilering af antistoffer, der genkender histoner og deres posttranslationelle modifikationer.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion og oprensning af et terapeutisk antistof

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personlig peptid Arrays for påvisning af HLA Alloantibodies i organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering af Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Massespektrometri Profilering af potentielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produktion af proteoliposomer til funktionel analyse og antistofudvikling rettet mod membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...