Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Van Andel Research Institute en een onderzoeksbijdrage van de National Institutes of Health (CA181343) naar SBR

1. Installeren en uitvoeren van ArrayNinja <ol><li> Download en installeer Oracle Virtual Box van www.virtualbox.org. </li><li> Download en uncomprimeer de ArrayNinja virtuele machine (VM) van http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Open Virtual Box en voeg de ArrayNinja VM toe door op &#39;Machine&#39;, &#39;Add&#39; te klikken en selecteer arrayninja.vbox uit de map waar ArrayNinja VM is opgeslagen. </li><li> Start ArrayNinja door deze in Virtual Box te selecteren en op de groene &#39;start&#39; pijl te ...

De betrouwbaarheid van antilichamen in biomedische onderzoekstoepassingen is voornaamste 46 , 47 . Dit geldt met name in chromatin biochemie gezien de positie van antilichamen als belangrijke instrumenten voor de meerderheid van de technieken ontwikkeld om de overvloed en verdeling van histon PTMs te karakteriseren. Het protocol presenteerde hier details een geoptimaliseerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays om de histon ...

Genomisch DNA wordt elegant verpakt in de eukaryote celkern met histonproteïnen om chromatine te vormen. De herhalende subeenheid van chromatine is het nucleosoom, dat bestaat uit 147 basisparen DNA die rond een octamerische kern van histonproteïnen - H2A, H2B, H3 en H4 1 worden gewikkeld. Chromatine is in ruime mate georganiseerd in losgekoppelde euchromatine en strak verpakte heterochromatin domeinen. De mate van chromatine compactie regelt de mate waarin eiwit machines kunnen toegang krijgen tot het onderliggende DNA om fundamentele DNA-templated processen zoals replicatie, transcriptie en reparatie uit te voeren. Belangrijke regelgevers van de toegankelijkheid van genoom in het kader van chromatine zijn PTM&#39;s op de niet-gestructureerde staart- en kerndomeinen van histonproteïnen 2 , 3 . Histon PTM&#39;s functioneren direct door de structuur van chromatine 4 en indirecte invloed te beïnvloedenH de aanwerving van lezerproteïnen en hun bijbehorende macromoleculaire complexen die chromatine remodellerende, enzymatische en steigerwerk hebben 5 . Studies van histone PTM functie over de afgelopen twee decennia suggereren overweldigend deze markeringen spelen sleutelrollen bij het reguleren van celfate, organismeontwikkeling en ziekte-initiatie / progressie. Gevoed door de vooruitgang in de massaspectrometrie gebaseerde proteomische technologie, zijn meer dan 20 unieke histon PTM&#39;s op meer dan 80 verschillende histonenresiduen ontdekt 6 . In het bijzonder komen deze wijzigingen vaak voor bij combinaties, en in overeenstemming met de hypothese van de histoncodes, zijn tal van studies aan te geven dat lezerproteïnen gericht zijn op discrete gebieden van chromatine door herkenning van specifieke combinaties van histon PTMs 7 , 8 , 9 . Een belangrijke uitdaging voorwaarts is om functies toe te wijzen aan de grDoor een lijst van histon PTM&#39;s en om te bepalen hoe specifieke combinaties van histon PTM&#39;s de dynamische functies die geassocieerd zijn met chromatine orchestreeren. Antilichamen zijn de lynchpin reagentia voor de detectie van histon PTMs. Als zodanig zijn meer dan 1000 histon PTM-specifieke antilichamen commercieel ontwikkeld voor toepassing in chromatin biochemieonderzoek. Met de snelle ontwikkeling van DNA-sequencing technologie met hoge doorstroming worden deze reagentia extensief gebruikt door individuele onderzoekers en grootschalige epigenomische &quot;roadmap&quot; -initiatieven ( bijv . ENCODE en BLUEPRINT) in ChIP-seq (chromatine immunoprecipitatie gekoppeld aan volgende generatie sequencing ) Pijpleidingen voor het genereren van hoge-resolutie ruimtelijke kaarten van histone PTM-distributie genoom-breed 10 , 11 . Echter, recente onderzoeken hebben aangetoond dat de specificiteit van histon PTM antilichamen zeer sterk kan zijn en dat deze reagentia onbeschikbaar zijn<html> Waardevolle epitoopherkenning, sterke positieve en negatieve invloed van naburige PTM&#39;s en moeilijkheden om de modificatieorde op een bepaald residu te discrimineren ( bijvoorbeeld mono-, di- of tri-methyllysine) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Daarom is strenge kwaliteitscontrole van histon PTM-specifieke antilichaamreagentia nodig om de gegenereerde gegevens met deze waardevolle reagentia nauwkeurig te interpreteren. Microarray technologie zorgt voor gelijktijdige ondervraging van duizenden macromoleculaire interacties in een high-throughput, reproduceerbare en miniatuurformaat. Om deze reden zijn een verscheidenheid aan microarray platforms gecreëerd om eiwit-DNA 19 te analyseren ,&quot;&gt; 20, eiwit-eiwit 21 en eiwit-peptide interacties 22. Inderdaad, histone peptide microarrays zijn opgevat als een informatief ontdekkingsplatform voor chromatin biochemie onderzoek, waardoor high-performance profielen van de schrijvers, wisers en lezers van histone PTMs 15 mogelijk zijn. , 23, 24, en tevens voor de analyse van histon antilichaamspecificiteit 17, 25. Naast hun toepassing in chromatine en epigenetica onderzoek histonpeptide arrays potentiële bruikbaarheid als een diagnostische / prognostische test voor systemische lupus erythematosus en andere auto-immuun ziekten waarbij anti- Chromatine auto-antilichamen worden gegenereerd 26 , 27 . Hier beschrijven we een geïntegreerde pijpleiding die we hebben ontwikkeld voor het ontwerpen, fabriceren en queHistone peptide microarrays rijst om specificiteitsprofielen te genereren voor antilichamen die histonen en hun PTM&#39;s herkennen. De pijplijn wordt vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source, interactieve software applicatie die we onlangs hebben ontwikkeld, die de ontwerp- en analysestadia van microarray-experimenten 28 integreren. ArrayNinja werkt het best in Google Chrome. In het kort wordt een robot-contact microarray printer gebruikt om een ​​bibliotheek van biotine-geconjugeerde histonpeptiden te deponeren op bepaalde posities op streptavidine-beklede glasmicroscoopschuiven. Arrays kunnen dan in een competitief en parallel assayformaat gebruikt worden om antilichaam-epitoopinteracties te ondervragen ( Figuur 1 ). De peptidebibliotheek bestaat uit honderden unieke synthetische peptiden die PTM&#39;s bevatten (lysine acetylering, lysine / arginine methylering en serine / threonine fosforylering) en in relevante combinaties die grotendeels afkomstig zijn uit proteomische datasets. Methoden voor peptidsynthese en validatie<html> Zijn elders gedetailleerd beschreven 23 . Gegevens die worden gegenereerd uit onze lopende histone PTM antilichaam screening inspanningen gebruik maken van dit array platform worden gearchiveerd op een openbare web resource, de Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Met name zijn histonepeptidemicroarrays die zijn vervaardigd met variaties van dit protocol, uitgebreid gebruikt om de activiteit van histone PTM-lezer domeinen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 en meer recentelijk te profileren histone PTM-schrijver- en gumwerkactiviteiten 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Beeldvertoning van de stapse procedure voor het screenen van antilichamen op een microfoon van een histonpeptide. Biotinyleerde histonpeptiden die gedefinieerde post-translationele modificaties (rode en blauwe cirkels) bevatten, worden geco-gedrukt met biotine-fluoresceïne op streptavidine-gecoat glas. Positieve interacties worden weergegeven als rode fluorescentie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Post-translationele modificaties (PTM&#39;s) op histonproteïnen worden op grote schaal onderzocht voor hun rol bij het reguleren van chromatinestructuur en genexpressie. De massaproductie en distributie van antilichamen die specifiek zijn voor histone PTM&#39;s, hebben dit onderzoek op grote schaal vergemakkelijkt. Aangezien histon PTM-antilichamen belangrijke reagentia zijn voor veel chromatin-biochemie toepassingen, is een nauwkeurige analyse van antilichaamspecificiteit noodzakelijk voor nauwkeurige data-interpretatie en voortdurende vooruitgang op het gebied. Dit protocol beschrijft een geïntegreerde pijpleiding voor het ontwerp, fabricage en gebruik van peptide microarrays voor het profileren van de specificiteit van histonantilichamen. De ontwerp en analyse aspecten van deze procedure worden vergemakkelijkt door ArrayNinja, een open source en interactief softwarepakket dat we onlangs ontwikkeld hebben om de aanpassing van microarrayformaten te stroomlijnen. Deze pijpleiding is gebruikt om een ​​groot aantal commercieel verkrijgbare en veel gebruikte histone PTM antibodies te screenenS, en gegevens die gegenereerd worden uit deze experimenten zijn vrij beschikbaar via een online en expanderende Histone Antibody Specificity Database. Naast histonen kan de hierin beschreven algemene methodologie in grote mate toegepast worden op de analyse van PTM-specifieke antilichamen.

Dit protocol is gebruikt om een ​​peptide microarray platform te ontwerpen en fabriceren voor de analyse van histon PTM antilichaam specificiteit. De array vraagt ​​een bibliotheek met meer dan 300 unieke peptidefuncties (20 tot 40 resten in lengte), die veel van de bekende combinaties van PTM&#39;s vertegenwoordigen, gevonden op kern- en varianthistonproteïnen 38 . Deze pijpleiding is een werkhorst voor het screenen van veel veelgebruikte en in de handel...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Gemakkelijke manipulatie van platforms in op basis van eiwitten Hydrogels voor cel cultuur toepassingen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...