Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מכון המחקר ואן אנדל ומענק מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות (CA181343) כדי SBR

1. התקנה והפעלת ArrayNinja <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן את Oracle Virtual Box מתוך www.virtualbox.org. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד או לבטל את הדחיסה של מכונה וירטואלית ArrayNinja (VM) מ http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח Virtual Box ולהוסיף את ArrayNi...

אמינות נוגדנים ביישומים רפואיים ביו-רפואיים היא בעלת חשיבות עליונה 46 , 47 . זה נכון במיוחד בביוכימיה הכרומטין בהתחשב בעמדה של נוגדנים כמו כלי מפתח עבור רוב הטכניקות שפותחו כדי לאפיין את שפע והפצה של PTMs היסטון. הפרוטוקול המוצג כאן פרטים ?...

הדנ&quot;א הגנומי הוא ארוז באלגנטיות בתוך גרעין התא האוקריוטים עם חלבונים היסטון ליצירת הכרומטין. יחידת המשנה של הכרומטין היא הנוקלאוזום, המורכב מ -147 זוגות בסיס של דנ&quot;א עטופים סביב ליבה אוקטמית של חלבונים היסטוניים - H2A, H2B, H3 ו- H4 1 . הכרומטין מאורגן באופן כללי לתוך euchromatin ארוז רופף ותחומים heterochromatin ארוז בחוזקה. מידת הדחיסה הכרומטין מסדירה את המידה שבה machineries חלבון יכול לגשת DNA הבסיסית לבצע תהליכים בסיסיים DNA תבניות כמו שכפול, שעתוק, ותיקון. רגולטורים עיקריים של נגישות הגנום בהקשר של הכרומטין הם PTM על זנב בלתי מובנה ותחומי הליבה של חלבונים היסטון 2 , 3 . Histone PTMs לתפקד ישירות על ידי השפעה על המבנה של הכרומטין 4 בעקיפין througH גיוס של חלבונים הקורא מתחמי macromolecular הקשורים להם כירומטין שיפוץ, פעילויות אנזימטיות, פיגומים 5 . מחקרים של פונקציה PTM היסטון במהלך שני העשורים האחרונים להצביע על הסימנים האלה לשחק תפקידים מרכזיים בוויסות גורל התא, התפתחות אורגניזמים, ואת תחילת המחלה / התקדמות. מונעת על ידי ההתקדמות של הטכנולוגיה מבוסס proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה, יותר מ -20 PTMs היסטון ייחודי על יותר מ 80 שאריות היסטון שונים התגלו 6 . יש לציין כי שינויים אלה מתרחשים לעיתים קרובות בשילובים, ועולים בקנה אחד עם ההשערה &quot;קוד היסטון&quot;, מחקרים רבים מציעים כי חלבונים הקורא ממוקדות אזורים נפרדים של הכרומטין באמצעות הכרה של שילובים ספציפיים של PTMs היסטון 7 , 8 , 9 . אתגר מפתח להתקדם יהיה להקצות פונקציות לגררשימה של htone PTMs ולקבוע כיצד שילובים ספציפיים של PTMs היסטון לתזמר את הפונקציות דינמי הקשורים הכרומטין. נוגדנים הם ריאגנטים lynchpin עבור זיהוי של PTMs היסטון. ככזה, יותר מ -1,000 נוגדנים ספציפיים PTM ספציפי היסטון פותחו מסחרית לשימוש במחקר ביוכימיה הכרומטין. עם התפתחות מהירה של התפוקה גבוהה דנ&quot;א טכנולוגיית רצף, ריאגנטים אלה נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בודדים בקנה מידה גדול epigenomics &quot;מפת הדרכים&quot; יוזמות ( למשל , ENCODE ו BLUEPRINT) ב שבב- seq (כרום immunoprecipitation הכרומטין עם הדור הבא רצף ) צינורות ליצור ברזולוציה גבוהה מפות מרחביות של היסטון PTM היסטון גנום רחב 10 , 11 . עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון יכול להיות משתנה מאוד וכי ריאגנטים אלה התערוכה unf<html> תכונות אבורייביות כגון הכרה ב- epitope מחוץ להשפעה, השפעה חיובית ושלילית חזקה על-ידי PTM שכנות וקושי בהבחנה של סדר השינוי על שאריות מסוימת ( לדוגמה , מונו-די- או טרי-מתילייזין) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, בקרת איכות קפדנית של ריאגנטים נוגדנים ספציפיים היסטון PTM יש צורך לפרש במדויק נתונים שנוצרו עם אלה ריאגנטים יקר. טכנולוגיית Microarray מאפשרת חקירה סימולטנית של אלפי אינטראקציות macromolecular בתפוקה גבוהה, לשחזור, ואת פורמט ממוזער. מסיבה זו, מגוון של פלטפורמות microarray נוצרו לנתח חלבון DNA 19 ,&quot;20, חלבון 21 חלבון, אינטראקציות חלבונים פפטיד 22. אכן, microstrays פפטיד היסטון צמחו כפלטפורמה גילוי אינפורמטיבי עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין, המאפשר פרופיל התפוקה גבוהה של סופרים, מחקים, ו הקוראים של PTMs היסטון 15 , 23 , 24 , וכן לניתוח של נוגדנים הנוגדן היסטון 17 , 25. מעבר ליישום שלהם במחקר הכרומטין ו epigenetics, מערכי פפטיד היסטון יש פוטנציאל השירות כמו אבחון / בדיקה פרוגנוסטית זאבת מערכתית אריתמטוס ומחלות אוטואימוניות אחרות שבו אנטי- נוגדנים עצמיים הכרומטין נוצרים 26 , 27 . כאן, אנו מתארים צינור משולב שפיתחנו עבור עיצוב, בודה, queRyan histone microptrays פפטיד כדי ליצור פרופילים ספציפיות עבור נוגדנים לזהות histones ו PTM שלהם. צינור הוא הקל על ידי ArrayNinja, קוד פתוח, יישום תוכנה אינטראקטיבית כי פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויים microarray 28 . ArrayNinja עובד הכי טוב ב- Google Chrome. בקצרה, מדפסת microarray קשר רובוטית משמש להפקיד ספריה של פפטידים היסטון ביוטין מצומדות במיקומים מוגדרים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית streptavidin מצופה. מערכים לאחר מכן ניתן להשתמש בפורמט assay תחרותי במקביל לחקור אינטראקציות נוגדן-epitope ( איור 1 ). הספריה פפטיד מורכב מאות פפטידים סינתטיים ייחודי מחסה PTMs (ליזין acetylation, ליזין / מתילציה ארגינין, ו serine / threonine זרחון) לבד בשילובים רלוונטיים נגזר בעיקר מן הנתונים datasets proteomics. שיטות סינתזה פפטיד ואימות<html> מפורטים במקום אחר 23. נתונים שנוצרו על ידי המתמשך שלנו histone PTM נוגדנים בדיקות הסינון באמצעות פלטפורמת מערך זה מאוחסנים על משאב אינטרנט ציבורי, היסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים (www.histoneantibodies.com). יש לציין, כי microarrays היסטון פפטיד מפוברק עם וריאציות של פרוטוקול זה שימשו גם בהרחבה כדי לאפיין את פעילותם של תחומים הקורא PTM היסטון 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ולאחרונה פרופיל היסטון PTM סופר ומחק פעילויות 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: תיאור קריקטורה של נוהל שלב של הקרנת נוגדנים על micropray פפטיד היסטון. פפטידים היסטון Biotinylated מחסה שינויים שלאחר טרנסלציה מוגדרים (עיגולים אדומים וכחולים) מודפסים בשיתוף עם biotin-fluorescein על זכוכית מצופה streptavidin. אינטראקציות חיוביות הם דמיינו כמו פלואורסצנטי אדום. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

לאחר שינויים טרנסלציוניים (PTM) על חלבונים היסטון נחקרים באופן נרחב עבור תפקידים שלהם ויסות מבנה הכרומטין ביטוי גנים. ייצור המוני והפצה של נוגדנים ספציפיים PTMs היסטון יש להקל מאוד מחקר על סימנים אלה. כמו נוגדנים PTM היסטון הם ריאגנטים מפתח עבור יישומים ביוכימיה רבים הכרומטין, ניתוח קפדני של נוגדנים הספציפיות נחוץ לפרש נתונים מדויק והמשך ההתקדמות בתחום. פרוטוקול זה מתאר צינור משולב עבור ייצור, ייצור ושימוש של microprays פפטיד עבור אפיון הספציפיות של נוגדנים היסטון. עיצוב וניתוח היבטים של הליך זה הם הקלו על ידי ArrayNinja, קוד פתוח וחבילת תוכנה אינטראקטיבית פיתחנו לאחרונה כדי לייעל את ההתאמה האישית של פורמטים להדפיס microarray. צינור זה שימש למסך מספר רב של antibodie PTM זמין מסחרית בשימוש נרחבS, ונתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי דרך האינטרנט והרחבת ההיסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים. מעבר היסטונים, המתודולוגיה הכללית המתוארת כאן ניתן ליישם באופן רחב לניתוח של נוגדנים ספציפיים PTM.

פרוטוקול זה שימש לעיצוב לפברק פלטפורמת microarray פפטיד לניתוח של סגוליות נוגדנים PTM היסטון. מערך שאילתות ספריה של יותר מ -300 תכונות פפטיד ייחודי (20 - 40 שאריות באורך) המייצג רבים של שילובים ידוע של PTMs למצוא על הליבה חלבונים היסטון חלופה 38 . צינו...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...