Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Van Andel Research Institute e da una borsa di studio degli Istituti Nazionali di Sanità (CA181343) a SBR

1. Installazione e esecuzione di ArrayNinja <ol><li> Scaricare e installare Oracle Virtual Box da www.virtualbox.org. </li><li> Scaricare e decomprimere la macchina virtuale ArrayNinja (VM) da http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Aprire Virtual Box e aggiungere l&#39;ArrayNinja VM facendo clic su &quot;Machine&quot;, &quot;Aggiungi&quot; e selezionando arrayninja.vbox dalla cartella in cui è stato salvato ArrayNinja VM. </li><li> Avviare ArrayNinja selezionandolo all&#39;interno di Virtual Box e facend...

L&#39;affidabilità degli anticorpi nelle applicazioni di ricerca biomedica è fondamentale 46 , 47 . Ciò è particolarmente vero nella biochimica cromatica data la posizione degli anticorpi come strumenti chiave per la maggior parte delle tecniche sviluppate per caratterizzare l&#39;abbondanza e la distribuzione di PTM istoniche. Il protocollo qui presentato illustra una pipeline ottimizzata per la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di microarray pept...

Il DNA genomico è imballato elegantemente all&#39;interno del nucleo delle cellule eucariotiche con proteine ​​dell&#39;istone per formare la cromatina. La subunità ripetizione della cromatina è il nucleosoma, che consiste di 147 coppie di basi di DNA avvolto attorno ad un nucleo octameric di proteine istoni H2A, - H2B, H3, H4 e 1. La cromatinica è ampiamente organizzata in euchromatin pienamente ricoperti e domini eterocromatina strettamente confezionati. Il grado di compattazione della cromatina regola la misura in cui i macchinari di proteine ​​possono accedere al DNA sottostante per eseguire processi fondamentali del DNA come la replica, la trascrizione e la riparazione. I regolatori chiave dell&#39;accessibilità del genoma nel contesto della cromatina sono PTM sui nodi non strutturati e nuclei delle proteine ​​istone 2 , 3 . Histon PTMs funziona direttamente influenzando la struttura della cromatina 4 e indirettamenteH l&#39;assunzione di proteine ​​di lettura e dei loro complessi macromolecolari associati con attività di ricostruzione cromatica, enzimatica e di ponteggi 5 . Studi sulla funzione istone PTM negli ultimi due decenni suggeriscono in maniera massiccia che questi segni svolgono ruoli chiave nel regolare il destino cellulare, lo sviluppo organico e l&#39;iniziazione / progressione delle malattie. Alimentata dai progressi della tecnologia proteomica basata sulla spettrometria di massa, sono stati scoperti più di 20 PTM istonici unici su più di 80 residui istoniali distinti 6 . Notevolmente, queste modifiche spesso si verificano in combinazioni e coerenti con l&#39;ipotesi del codice istone, numerosi studi suggeriscono che le proteine ​​del lettore sono destinate a regioni discrete di cromatina attraverso il riconoscimento di combinazioni specifiche di istone PTMs 7 , 8 , 9 . Una sfida fondamentale in avanti sarà attribuire funzioni al grGrazie alla lista degli istoni PTMs e per determinare come combinazioni specifiche di PTM istoni orchestrino le funzioni dinamiche associate alla cromatina. Gli anticorpi sono i reagenti lynchpin per la rilevazione di PTM istonico. In quanto tale, più di 1.000 anticorpi specifici PTM-istone sono stati commercialmente sviluppati per l&#39;uso nella ricerca biochimica cromatina. Con il rapido sviluppo di high-throughput tecnologia di sequenziamento del DNA, questi reagenti sono stati ampiamente utilizzati dai singoli ricercatori e epigenomics grandi &quot;calendario&quot; iniziative (ad esempio, codificare e progetto), in ChIP-seq (cromatina immunoprecipitazione accoppiato con sequenziamento di prossima generazione ) Per generare mappe spaziali ad alta risoluzione della distribuzione istone PTM a livello genomico 10 , 11 . Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che la specificità degli anticorpi PTM dell&#39;istone può essere altamente variabile e che questi reagenti presentano<html> Proprietà avorabili come il riconoscimento epitopico fuori bersaglio, forte influenza positiva e negativa da parte dei PTM vicini e difficoltà a discriminare l&#39;ordine di modifica su un determinato residuo ( ad esempio mono-, di- o tri-metililossina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Pertanto, è necessario un controllo rigoroso della qualità dei reagenti anticorpo specifico PTM-istone per interpretare con precisione i dati generati con questi reagenti preziosi. La tecnologia Microarray consente di interrogare simultaneamente migliaia di interazioni macromolecolari in un formato ad alta produttività, riproducibile e miniaturizzato. Per questo motivo, sono state create diverse piattaforme di microarray per analizzare il DNA proteico 19 ,&quot;&gt; 20, proteine-proteine 21 e proteine-peptide interazioni 22. In effetti, i microarray di peptide dell&#39;istone sono emerse come una piattaforma di scoperta informativa per la ricerca di biochimica cromatica, consentendo una profilazione ad alta velocità degli scrittori, cancellatori e lettori di istone PTMs 15 , 23 , 24 e anche per l&#39;analisi della specificità degli anticorpi degli istoni 17 , 25. Oltre alla loro applicazione nella ricerca di cromatina e epigenetica, gli array di peptone istonico hanno potenziale utilità come test diagnostico / prognostico per il lupus eritematoso sistemico e altre malattie autoimmuni, Gli anticorpi cromatici vengono generati 26 , 27 . Qui descriviamo una pipeline integrata che abbiamo sviluppato per la progettazione, la fabbricazione e la queMicroarrays di peptide istone per generare profili di specificità per gli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro PTM. Il gasdotto è facilitata da ArrayNinja, un open-source, un&#39;applicazione software interattivo che abbiamo recentemente sviluppato, che integra le fasi di progettazione e di analisi di esperimenti di microarray 28. ArrayNinja funziona meglio in Google Chrome. In breve, viene utilizzata una stampante microarray a contatto robotizzato per depositare una biblioteca di peptidi istoni coniugati biotina in posizioni definite su vetrini a microscopio vetrato con streptavidina. Le matrici possono quindi essere utilizzate in un modo conciso e in parallelo di test per interrogare le interazioni con gli anticorpi-epitopi ( Figura 1 ). La biblioteca del peptide è costituita da centinaia di peptidi sintetici unici che ospitano PTM (acetilazione lisina, metilazione lisina / arginina e fosforilazione serina / treonina) da soli e in combinazioni pertinenti in gran parte derivate da set di dati proteomici. Metodi per la sintesi e la convalida dei peptidi<html> Sono dettagliate altrove 23 . I dati generati dagli sforzi di screening degli anticorpi PTH istantanei in corso utilizzando questa piattaforma di array sono archiviati in una risorsa web pubblica, il database di specificità degli anticorpi Histone (www.histoneantibodies.com). In particolare, i microarray di peptide istone fabbricati con variazioni di questo protocollo sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare l&#39;attività dei domini di lettore di istone PTM 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e più recentemente all&#39;istone del profilo PTM scrittore e attività gomma 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Disposizione del fumetto della procedura stepwise per la screening degli anticorpi su un microarray di peptide dell&#39;istone. I peptidi biotinilati di istone che ospitano modifiche post-traslazionali definite (cerchi rossi e blu) sono stampati con biotina-fluoresceina sul vetro rivestito con streptavidina. Le interazioni positive sono visualizzate come fluorescenza rossa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sulle proteine ​​dell&#39;istone sono ampiamente studiate per i loro ruoli nella regolazione della struttura cromatica e dell&#39;espressione genica. La produzione di massa e la distribuzione di anticorpi specifici ai PTM istonici ha facilitato notevolmente la ricerca su questi segni. Poiché gli anticorpi PTM dell&#39;istone sono reagenti chiave per molte applicazioni di biochimica cromatica, è necessaria un&#39;analisi rigorosa della specificità degli anticorpi per un&#39;accurata interpretazione dei dati e un progresso continuo nel campo. Questo protocollo descrive una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di microarray peptidi per la profilazione della specificità degli anticorpi istoni. Gli aspetti di progettazione e analisi di questa procedura sono facilitati da ArrayNinja, un pacchetto software open source e interattivo che abbiamo recentemente sviluppato per semplificare la personalizzazione dei formati di stampa con microarray. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un gran numero di anticorpi anti-PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzatiE i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili tramite un database di specificità anticorpo istante in linea e in espansione. Al di là degli istoni, la metodologia generale descritta qui può essere applicata ampiamente all&#39;analisi degli anticorpi PTM-specifici.

Questo protocollo è stato utilizzato per progettare e realizzare una piattaforma microarray peptide per l&#39;analisi della specificità degli anticorpi PTM. L&#39;array richiede una libreria di più di 300 funzionalità peptide uniche (20-40 residui di lunghezza) che rappresentano molte delle combinazioni note di PTM trovate sulle proteine ​​di istone del nucleo e delle varianti 38 . Questa pipeline è stata un cavallo di lavoro per lo screening di molti ant...

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

The goal of this video is to describe an integrated pipeline for the design fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificities of histone antibodies. Antibodies that recognize histones and their diverse post-translational modifications are key reagents in chromatin biochemistry research. We rely on these tools to deepen our understanding of histone modification function.Recent studies reveal inconsistencies in histone antibody behavior. As antibody choice is the most critical element in epigenetics experiments, vigorous incomprehensive quality control measures are demanded for these reagents. Here, we demonstrate an integrated pipeline we'd developed for designing, fabricating and analyzing peptide microarrays to generate specificity profiles for antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.The pipeline is facilitated by Array Ninja, an open source interactive software application that we developed, which integrates the design and analysis stages of microarray experiments. To begin designing the array slide, under the plan a slide layout heading, select the microarray printer that will be used. Then, type, empty in the load plate field and press enter.Set the spot diameter to 275 micrometers and the spot spacing to 100 micrometers. Fill in the remaining parameters appropriately for the experiment, ensuring that the layout allows for sufficient replicates. At the resulting layout preview, mouse over each unique peptide feature on the slide and enter a feature identifier in the popup text box.Once each unique feature has been labeled, click populate. Name the slide layout, and click commit your plate to save the layout and generate a map at the physical locations of each feature in the source plates. Guided by the source plate map, load one to two microliters of each peptide feature into the designated wells of one or more 384 wells, small volume plates, dilute each feature 10 fold with 1x protein microarray printing buffer, supplemented with 1%bovine serum albumin and five micrograms per microliter fluorescin labeled biotin.Then, centrifuge the plates at 500 x G at room temperature for two minutes. Next, empty the waste container at the microarray printer. Fill the washed solution in humidifier containers with sterile distilled water.Enter the array slide parameters in the microarray printer software. Set the washing procedure to a one second wash with the single immersion, the post washed to redip the pins five times, and the humidity to 60%Then, insert encoated glass slides into the substrate platinums. Load the platinums into the platinum elevator.Insert the source plates into the plate holders and load the holders into the source plate elevator. Run the printing process, then, remove the substrate platinums from the instrument. Block the printed slides with 1x protein microarray blocking buffer for 30 minutes while shaking.Then, wash the slides in room temperature, pH 7.6 phosphate buffered saline for 10 minutes. Repeat the wash with a fresh batch of PBS. Dry the slides by centrifugation for 30 seconds at room temperature.Next, pre-heat a microarray wax imprinter at 85 degrees celsius for 30 minutes, or until the wax has melted. Then, insert a slide printed side down, into the holder and align the holder with the imprinter mold. Bring the mold into contact with the slide and hold for two seconds, then, quickly remove the slide from the holder and inspect the wax borders to verify that the arrays are properly enclosed.Store the partitioned slides at four degrees celsius, in a dry dark area. To begin the hybridization procedure, place a partitioned array slide in a plastic dish and cover the slide with hybridization buffer. Equilibrate the slide for 30 minutes at four degree celsius, while shaking at low speed.Dry the slide by spinning in a microarray slide centrifuge at room temperature. Then, add five microliters of each histone PTM antibody solution to at least two wells of the array and incubate at four degree celsius for one hour. Following incubation, remove the antibody solution and wash the array with cold PBS three times for five minutes each at four degrees celsius.Next, incubate the array in a fluorescent dye-conjugated secondary antibody solution. For 30 minutes at four degrees celsius, in the absence of light. Wash the slide three times with cold PBS as before.Dip the array in room temperature 0.1x PBS to remove excess salt and dry the slide by brief centrifugation at room temperature. Image the slide with a microarray scanner at a resolution of at least, 25 microns. To begin the analysis, use image processing software to merge the single channel files from the microarray scanner.Then, open Array Ninja and select the appropriate microarray printer under the, to quantify images header. Fill in the name of the same slide layout in the load plate dialog box, and press enter. Load the merged image file, and adjust the contrast, brightness and mid point as desired.Fill in the array scanner resolution, adjust the top and side margins to align slide layout grid with the image. To analyze a set of wells as replicates or perform other selective analysis, fill in the well coordinates in the iPin, jPin, and subA fields and press enter. Click to toggle zoom, to display a magnified image of the area under the cursor.Then, click spot seek and wait for the process to finish. Repeat the seek function as needed to center the grid circles on the array spots. Reference spots can be selected by pressing the R key and spot showing debris or widely bearing morphology can be deactivated by pressing the A key while hovering over the spot.Once the background reference spots have been selected, and spots with pore morphology or contamination have been deactivated, click populate, followed by, submit to perform the quantification. A bar graph and table will be displayed in a new page. The binding specificities of two histone PTM antibodies were evaluated using this method.A histone PTM antibody designed to target trimethylated lysine 9 on histone H3 was also found to bind to three other trimethylated lysine groups. A silylation of neighboring lysine residues was observed to positively influence targeting of lysine 9 on H3.A histone PTM antibody targeting trimethylated lysine 4 on histone H3, was found to interact with singlely methylated and dimethylated lysine 4 on H3 as well. Phosphorelation of the neighboring three anine six, was observed to negatively impact binding at lysine four in this assay.This pipeline has been used to screen many of the most widely used, commercially available histone antibodies and data generated from these experiments is freely available through the histone antibody specificity database. Variations to this pipeline have been previously described for the analysis of histone readers, writers and erasers, modifying this platform before utility beyond epigenetics research could be easily for any printable library of interest. Several histone peptide microarray platforms are available commercially for users who do not have access to the specialized equipment needed to synthesize peptides and fabricate arrays.

Research

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Biochemistry

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Biochimica

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Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

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