Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
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この研究は、部分的には、Van Andel Research Instituteによって支援され、国立衛生研究所（CA181343）からSBR

1. ArrayNinjaのインストールと実行<ol><li> www.virtualbox.orgからOracle Virtual Boxをダウンロードしてインストールします。 </li><li> http://research.vai.org/Tools/arrayninjaからArrayNinja仮想マシン（VM）をダウンロードして解凍します。 </li><li>バーチャルボックスを開き、 &#39;Machine&#39;、 &#39;Add&#39;をクリックしてArrayNinja VMを追加し、ArrayNinja VMが保存されていたフォルダからarrayninja.vboxを選択します。 </li><li>仮...

生物医学研究用途における抗体の信頼性が最優先事項46、47です。これは、ヒストンPTMの存在量および分布を特徴付けるために開発された技術の大部分のための重要なツールとしての抗体の位置を考慮すると、クロマチン生化学において特に当てはまります。ここに示されたプロトコルは、ヒストンPTM抗体特異性を分析するためのペプチドマイクロ?...

ゲノムDNAは、ヒストンタンパク質を含む真核細胞の核内にエレガントにパッケージングされ、クロマチンを形成する。クロマチンの反復サブユニットはヌクレオソームであり、これはヒストンタンパク質の八量体コア（H2A、H2B、H3、およびH4 1）のまわりに包まれた147塩基対のDNAからなる。クロマチンは、ゆるやかに詰まったユークロマチンおよび密に詰まったヘテロクロマチンドメインに広く組織されている。クロマチン圧縮の程度は、複製、転写、および修復のような基本的なDNA鋳型プロセスを実行するために、タンパク質機械が根底にあるDNAにアクセスできる程度を調節する。 クロマチンの文脈におけるゲノムアクセシビリティの重要な調節因子は、ヒストンタンパク質2、3の構造化されていない尾とコアドメイン上のPTMです。ヒストンPTMは、クロマチン4の構造に直接的に作用し、間接的に作用する染色体リモデリング、酵素的および足場活性を有するリーダータンパク質および関連する巨大分子複合体の動員5 。過去20年にわたるヒストンPTM機能の研究は、これらのマークが細胞運命、生物発達、および疾患の開始/進行の調節において重要な役割を果たすことを圧倒的に示唆している。質量分析に基づくプロテオーム技術の進歩により、80以上の異なるヒストン残基に20以上のユニークなヒストンPTMが発見されました6 。注目すべきことに、これらの修飾は、しばしば組み合わせで発生し、「ヒストンコード」仮説と一致して、多くの研究は、リーダタンパク質がヒストンのPTM 7、8、9の特定の組み合わせの認識を介してクロマチンの別個の領域を標的とすることを示唆しています。重要な課題は、関数をgrに割り当てることですヒストンPTMの特定の組み合わせがどのようにしてクロマチンに関連する動的機能を調整するかを決定することができる。 抗体は、ヒストンPTMの検出のためのリンチピン試薬である。このように、クロマチン生化学研究に使用するために、1,000を超えるヒストンPTM特異的抗体が商業的に開発されている。ハイスループットDNA配列決定技術の急速な発展に伴い、これらの試薬は、チップ配列の個々の研究者および大規模エピゲノミクス「ロードマップ」の取り組み（ 例えば 、ENCODEおよび青写真）によって広く使用されている（次世代シークエンシングと結合クロマチン免疫沈降）パイプラインヒストンPTM分布ゲノムワイド10、11の高解像度空間マップを生成します。しかし、最近の研究により、ヒストンPTM抗体の特異性は非常に可変であり得、これらの試薬は非<html>特定の残基に変更順序を識別ようなオフターゲットエピトープ認識、隣接のPTMによる強い正および負の影響、及び困難としてavorable特性（ 例えば 、モノ- 、ジ- 、またはトリ-メチルリジン）12、13、14、15 、16、17、18。したがって、これらの貴重な試薬で生成されたデータを正確に解釈するには、ヒストンPTM特異的抗体試薬の厳密な品質管理が必要です。 マイクロアレイ技術は、ハイスループットで、再現性があり、かつ小型化されたフォーマットで、何千もの高分子相互作用の同時検査を可能にする。このため、マイクロアレイプラットフォームの様々なタンパク質-DNA 19を分析するために作成されています、「&gt; 20、タンパク質-タンパク質21、及びタンパク質-ペプチド相互作用22。実際、ヒストンペプチドマイクロアレイは消しゴム、作家のハイスループットプロファイリングを可能にする、クロマチン生化学研究のための有益な発見プラットフォームとして浮上し、そしてヒストンのPTM 15の読者ました、23、24、またヒストン抗体特異性17、25の分析のため。クロマチンとエピジェネティクス研究におけるそれらの用途を超えて、ヒストンペプチド配列は、抗全身性エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患の診断/予後診断検査としての潜在的有用性を有しますクロマチン自己抗体は26、27を生成しています。 ここでは、設計、製造、および開発のために開発した統合パイプラインについて説明しますヒストンおよびそれらのPTMを認識する抗体の特異性プロファイルを生成するためにヒストンペプチドマイクロアレイをライニングする。このパイプラインは、我々が最近開発したオープンソースのインタラクティブなソフトウェアアプリケーションであるArrayNinjaによって容易にされ、マイクロアレイ実験の設計と解析段階を統合している28 。 ArrayNinjaはGoogle Chromeで最適に動作します。簡単に述べると、ロボット接触マイクロアレイプリンターを用いて、ストレプトアビジン被覆ガラス顕微鏡スライド上の規定された位置にビオチン結合ヒストンペプチドのライブラリーを沈着させる。次いで、抗体 - エピトープ相互作用を調べるために、競合的および並行アッセイ形式でアレイを使用することができる（ 図1 ）。ペプチドライブラリーは、PTM（リジンアセチル化、リシン/アルギニンメチル化、およびセリン/スレオニンリン酸化）を単独で、プロテオミクスデータセットに主に由来する関連する組み合わせを有する何百ものユニークな合成ペプチドからなる。ペプチド合成および検証のための方法<html>他の場所で詳述されている23 。このアレイプラットフォームを利用した、現在行われているヒストンPTM抗体スクリーニングの取り組みから得られたデータは、公開されているWebリソース、Histone Antibody Specificity Database（www.histoneantibodies.com）に保存されています。注目すべきことに、このプロトコルのバリエーションで製造ヒストンペプチドマイクロアレイはまた、ヒストンPTMリーダードメイン8、29、30、31、32、33、34、35、36、37の活性を特徴づけるために広く使用されており、より最近ヒストンをプロファイルしますPTMライターと消しゴムの活動24 。 /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：ヒストンペプチドマイクロアレイ上の抗体スクリーニングのための段階的手順の漫画の描写。定義された翻訳後修飾（赤色および青色の円）を有するビオチン化ヒストンペプチドを、ストレプトアビジン被覆ガラス上のビオチン - フルオレセインと同時プリントする。陽性の相互作用は、赤色蛍光として視覚化される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

ヒストンタンパク質の翻訳後修飾（PTM）は、クロマチン構造および遺伝子発現の調節におけるそれらの役割について広く研究されている。ヒストンPTMに特異的な抗体の大量生産および分布は、これらのマークの研究を非常に容易にした。ヒストンPTM抗体は多くのクロマチン生化学アプリケーションにとって重要な試薬であるため、正確なデータ解釈と現場での継続的な進歩には抗体特異性の厳密な解析が必要です。このプロトコルは、ヒストン抗体の特異性をプロファイリングするためのペプチドマイクロアレイの設計、製作および使用のための統合されたパイプラインを記載している。この手順の設計と分析の側面は、マイクロアレイ印刷フォーマットのカスタマイズを合理化するために最近開発したオープンソースのインタラクティブなソフトウェアパッケージであるArrayNinjaによって容易になります。このパイプラインは、市販されて広く使用されている多数のヒストンPTM抗体のスクリーニングに使用されているこれらの実験から生成されたデータは、オンラインおよび拡大Histone Antibody Specificity Databaseを通じて自由に入手できます。ヒストンを越えて、本明細書に記載の一般的な方法論は、PTM特異的抗体の分析に広く適用することができる。

このプロトコルは、ヒストンPTM抗体特異性の分析のためのペプチドマイクロアレイプラットフォームを設計し、製造するために使用されてきた。このアレイは、コアおよびバリアントヒストンタンパク質38に見られるPTMの既知の組み合わせの多くを表す、300を超える独自のペプチド機能（長さ20〜40残基）のライブラリを照会します38</sup...

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...