Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

1. Installere og kjøre ArrayNinja <ol><li> Last ned og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org. </li><li> Last ned og komprimer ArrayNinja virtuell maskin (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Åpne Virtual Box og legg til ArrayNinja VM ved å klikke &#39;Maskin&#39;, &#39;Legg til&#39;, og velg arrayninja.vbox fra mappen der ArrayNinja VM ble lagret. </li><li> Start ArrayNinja ved å velge den i Virtual Box og klikk på den grønne &quot;start&quot; -pilen. </li><li> Virtual Box å...

Antistoffets pålitelighet i biomedisinske søknader er viktigst 46 , 47 . Dette gjelder spesielt i kromatinbiokjemi gitt antistoffposisjon som nøkkelverktøy for flertallet av teknikker utviklet for å karakterisere overflaten og fordelingen av histon PTM. Protokollen presenterte her detaljer en optimalisert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for å analysere histon PTM antistoff spesifisitet. Denne rørledningen har blitt bruk...

Genomisk DNA pakkes elegant inn i eukaryotisk cellekjerne med histonproteiner for å danne kromatin. Den gjentatte underenheten av kromatin er nukleosomet, som består av 147 basepar DNA som er pakket rundt en oktamerisk kjerne av histonproteiner - H2A, H2B, H3 og H4 1 . Kromatin er bredt organisert i løst pakket eukromatin og tett pakket heterochromatin domener. Graden av kromatin-komprimering regulerer i hvilken grad proteinindustrien kan få tilgang til det underliggende DNA for å gjennomføre grunnleggende DNA-templerte prosesser som replikering, transkripsjon og reparasjon. Nøkkelregulatorer for genometilgjengelighet i forbindelse med kromatin er PTM på de ustrukturerte hale- og kjerneområdene av histonproteiner 2 , 3 . Histone PTMs fungerer direkte ved å påvirke strukturen av kromatin 4 og indirekte gjennomgåendeH rekruttering av leserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser som har kromatin remodeling, enzymatisk og stillas aktiviteter 5 . Studier av histone PTM-funksjon de siste to tiårene tyder overveldende på at disse merkene spiller nøkkelrolle i regulering av cellefell, organisasjonsutvikling og sykdomsinitiering / progresjon. Fueled av fremskritt i massespektrometribasert proteomteknologi, er det funnet mer enn 20 unike histon-PTM på mer enn 80 forskjellige histonrester 6 . Spesielt forekommer disse endringene ofte i kombinasjoner, og i samsvar med &quot;histonkoden&quot; -hypotesen, viser mange studier at leserproteiner er målrettet mot diskrete kromatinegrupper gjennom anerkjennelse av spesifikke kombinasjoner av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utfordring fremover vil være å tilordne funksjoner til grPå grunn av listen over histon PTMer og å bestemme hvordan bestemte kombinasjoner av histon PTMer orkestrerer de dynamiske funksjonene assosiert med kromatin. Antistoffer er lynchpinreagensene for påvisning av histon PTM. Som sådan har mer enn 1000 histon-PTM-spesifikke antistoffer blitt kommersielt utviklet for bruk i kromatisk biokjemiforskning. Med den raske utviklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med høy gjennomstrømning, brukes disse reagensene i stor grad av individuelle etterforskere og omfattende epigenomiske &quot;veikart&quot; -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfelling kombinert med neste generasjons sekvensering ) Rørledninger for å generere geografiske kart med høy oppløsning av histon PTM-fordelingsgenom-bred 10 , 11 . Nylige studier har imidlertid vist at spesifisiteten av histon-PTM-antistoffer kan være svært variabel og at disse reagensene viser uferdige<html> Dårlige egenskaper som ikke-mål epitopgjenkjenning, sterk positiv og negativ påvirkning av nabo-PTM, og vanskeligheter med å diskriminere modifikasjonsordren på en bestemt rest ( f.eks . Mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontroll av histon PTM-spesifikke antistoffreagenser nødvendig for å nøyaktig tolke data generert med disse verdifulle reagensene. Microarray-teknologi gjør det mulig for simultant forhør av tusenvis av makromolekylære interaksjoner i et gjennomgående, reproduserbart og miniatyrisert format. Av denne grunn har en rekke mikroarrayplattformer blitt opprettet for å analysere protein-DNA 19 ,&quot;&gt; 20, protein-protein 21 og protein-peptid-interaksjoner 22. Faktisk har histonpeptidmikroarrays oppstått som en informativ funningsplattform for kromatinbiokjemiforskning, som muliggjør høy gjennomstrømmingsprofilering av forfattere, viskelærer og lesere av histon PTM 15 , 23, 24, og også for analyse av histon-antistoffspesifisitet 17, 25. Utover deres anvendelse i kromatin og epigenetikk forskning, histon peptid-matriser har potensiell anvendelse som et diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sykdommer hvor anti- Kromatin-autoantistoffer blir dannet 26 , 27 . Her beskriver vi en integrert rørledning som vi har utviklet for å designe, fabrikere og kjøreRydder histonpeptidmikroarrays for å generere spesifisitetsprofiler for antistoffer som gjenkjenner histon og deres PTM. Rørledningen forenkles av ArrayNinja, et interaktivt program for åpen kildekode som vi nylig utviklet, som integrerer design- og analysestadene i mikroarray-eksperimenter 28 . ArrayNinja fungerer best i Google Chrome. Kort fortalt brukes en mikrokrysserskriver med robotkontakt til å deponere et bibliotek med biotinkonjugerte histonpeptider i definerte posisjoner på streptavidin-belagte glassmikroskopriller. Arrays kan da brukes i et konkurransedyktig og parallelt analyseringsformat for å forhøre antistoff-epitop-interaksjoner ( figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundrevis av unike syntetiske peptider som inneholder PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering og serin / treoninfosforylering) alene og i relevante kombinasjoner i stor grad avledet fra proteomiske datasett. Metoder for peptidsyntese og validering<html> Er detaljert andre steder 23 . Data generert fra vår pågående histone PTM antistoff screening innsats utnytte denne array plattformen er arkivert på en offentlig web ressurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Spesielt er histonpeptidmikroarrays fremstilt med variasjoner av denne protokollen blitt brukt i stor utstrekning for å karakterisere aktiviteten til histone PTM-leserdomene 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mer nylig for å profilere histon PTM forfatter og viskelærer 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Tegneserievisning av trinnvis prosedyre for antistoff-screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerte histonpeptider som inneholder definerte posttranslasjonelle modifikasjoner (røde og blå sirkler) er medtrykt med biotin-fluorescein på streptavidinbelagt glass. Positive interaksjoner visualiseres som rød fluorescens. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) på histonproteiner studeres mye for deres roller i regulering av kromatinstruktur og genuttrykk. Masseproduksjonen og fordelingen av antistoffer som er spesifikke for histon-PTM, har i stor grad tilrettelagt for forskning på disse merkene. Siden histon-PTM-antistoffer er nøkkelreagenser for mange kromatinbiokemiske applikasjoner, er streng analyse av antistoff-spesifisitet nødvendig for nøyaktig dataintolking og fortsatt fremgang i feltet. Denne protokollen beskriver en integrert rørledning for utforming, fabrikasjon og bruk av peptidmikroarrays for profiling av spesifisitet av histon-antistoffer. Design og analyse aspekter av denne prosedyren er lettet av ArrayNinja, en åpen kildekode og interaktiv programvarepakke vi nylig utviklet for å effektivisere tilpasningen av microarray utskriftsformater. Denne rørledningen har blitt brukt til å skjerme et stort antall kommersielt tilgjengelig og mye brukt histone PTM antibodiesS, og data generert fra disse forsøkene er fritt tilgjengelige gjennom en online og ekspanderende Histone Antibody Specificity Database. Utover histoner kan den generelle metode som beskrives her, anvendes bredt til analysen av PTM-spesifikke antistoffer.

Denne protokollen har blitt brukt til å designe og fremstille en peptidmikroarrayplattform for analyse av histon PTM antistoff-spesifisitet. Oppstillingen spør etter et bibliotek med mer enn 300 unike peptidfunksjoner (20 - 40 rester i lengden) som representerer mange av de kjente kombinasjonene av PTM som finnes på kjerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledningen har vært en arbeidshest for screening av mange brukte og kommersielt tilgjengelige hist...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Dette manuskriptet beskriver metoder for anvendelse av peptidmikroarray-teknologi til spesifisitetsprofilering av antistoffer som gjenkjenner histoner og deres posttranslasjonelle modifikasjoner.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Tilpasset peptid matriser for påvisning av HLA Alloantibodies i organtransplantasjon

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering av Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profilering av potensielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rask bestemmelse av antistoff-antigen affinitet av masse fotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produksjon av proteoliposomer for funksjonell analyse og antistoffutvikling rettet mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...