Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Научно-исследовательским институтом Ван Анделя и грантом исследований Национального института здоровья (CA181343) на SBR

1. Установка и запуск ArrayNinja <ol><li> Загрузите и установите Oracle Virtual Box с сайта www.virtualbox.org. </li><li> Загрузите и распакуйте виртуальную машину ArrayNinja (VM) с сайта http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Откройте Virtual Box и добавьте виртуальную машину ArrayNinja, нажав «Машина», «Добавить» и выберите arrayninja.vbox из папки...

Надежность антител в приложениях для биомедицинских исследований имеет первостепенное значение 46 , 47 . Это особенно актуально в биохимии хроматина, учитывая положение антител в качестве ключевых инструментов для большинства методов, разработанных для ...

Геномная ДНК изящно упакована внутри ядра эукариотической клетки с белками гистонов с образованием хроматина. Повторяющейся субъединицей хроматина является нуклеосома, которая состоит из 147 пар оснований ДНК, обернутых вокруг октамерного ядра гистоновых белков - H2A, H2B, H3 и H4 1 . Хроматин широко организован в свободно упакованный эухроматин и плотно упакованные домены гетерохроматинов. Степень уплотнения хроматина регулирует степень, в которой белковые механизмы могут получить доступ к основной ДНК для осуществления фундаментальных процессов, связанных с ДНК, таких как репликация, транскрипция и восстановление. Ключевыми регуляторами доступности генома в контексте хроматина являются ПТМ на неструктурированных хвостовых и основных доменах белков гистонов 2 , 3 . Гистоновые ПТМ функционируют напрямую, влияя на структуру хроматина 4 и косвенно проникаяH - набор белков-считывателей и связанных с ними макромолекулярных комплексов, которые имеют ремоделирование, ферментативную и лессификацию хроматина. 5 . Исследования функции гистонового ПТМ в течение последних двух десятилетий в подавляющем большинстве предполагают, что эти знаки играют ключевую роль в регулировании судьбы клеток, развития организма и инициирования / прогрессирования заболевания. Питаемые достижения в области масс - спектрометрия на основе протеомики технологии, более 20 уникальных гистоны PTMs на более чем 80 различных остатках гистонов были обнаружены 6. Примечательно, что эти модификации часто встречаются в комбинациях и согласуются с гипотезой «гистонового кода», многочисленные исследования показывают, что белки-считыватели нацелены на дискретные области хроматина посредством распознавания специфических комбинаций гистоновых ПТМ 7 , 8 , 9 . Ключевой задачей продвижения вперед будет назначение функций grКоторый содержит список гистоновых ПТМ и определяет, как конкретные комбинации гистоновых ПТМ организуют динамические функции, связанные с хроматином. Антитела - это линчпиновые реагенты для обнаружения гистоновых ПТМ. Таким образом, более 1000 гистоновых ПТМ-специфических антител были коммерчески разработаны для использования в исследованиях биохимии хроматина. С быстрым развитием высокопроизводительной технологии секвенирования ДНК эти реагенты широко используются отдельными исследователями и крупномасштабными инициативами «дорожной карты» эпигеномики ( например , ENCODE и BLUEPRINT) в ChIP-seq (иммунопреципитация хроматина в сочетании с последовательностью следующего поколения ) Для создания пространственных карт с высоким разрешением распределения генома гистонов в геноме 10 , 11 . Однако недавние исследования показали, что специфичность антител к гистону ПТМ может быть очень переменной и что эти реагенты проявляют<html> Приемлемые свойства, такие как распознавание нецелевого эпитопа, сильное положительное и отрицательное влияние со стороны соседних ПТМ и трудности, определяющие порядок модификации на определенном остатке ( например , моно-, ди- или триметиллизине) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Поэтому для точной интерпретации данных, полученных с помощью этих ценных реагентов, необходим строгий контроль качества реагентов антител, специфичных к гистону ПТМ. Технология Microarray позволяет одновременный опрос тысяч макромолекулярных взаимодействий в высокопроизводительном, воспроизводимом и миниатюрном формате. По этой причине были созданы различные платформы для микрочипов для анализа белковой ДНК 19 ,«&gt; 20, белок-белок 21 и белок-пептидные взаимодействия 22. Действительно, гистоновые пептидные микрочипы появились как информационная платформа для исследования биохимических свойств хроматина, позволяющая высокопрофильное профилирование писателей, ластиков и считывателей гистоновых ПТМ 15 , 23 , 24 , а также для анализа специфичности антител к гистону 17 , 25. Вне их применения в исследованиях хроматина и эпигенетики гистоновые пептидные массивы имеют потенциальную полезность в качестве диагностического / прогностического теста для системной красной волчанки и других аутоиммунных заболеваний, Хроматиновые аутоантитела генерируются 26 , 27 . Здесь мы описываем интегрированный конвейер, который мы разработали для проектирования, изготовления иДля получения микротипов гистоновых пептидов для получения профилей специфичности для антител, которые распознают гистоны и их ПТМ. Конвейер облегчается благодаря недавно разработанному ArrayNinja, интерактивному программному приложению с открытым исходным кодом, которое объединяет стадии проектирования и анализа экспериментов с микрочипами 28 . ArrayNinja работает лучше всего в Google Chrome. Вкратце, роботизированный контактный микрочиповый принтер используется для осаждения библиотеки биотин-конъюгированных гистоновых пептидов в определенных положениях на стеклянных микроскопах, покрытых стрептавидином. Затем массивы можно использовать в конкурентном и параллельном анализе для опроса антитело-эпитопных взаимодействий ( рис. 1 ). Библиотека пептидов состоит из сотен уникальных синтетических пептидов, содержащих PTM (ацетилирование лизина, метилирование лизина / аргинина и фосфорилирование серина / треонина) и в соответствующих комбинациях, в основном полученных из наборов данных протеомики. Методы синтеза и валидации пептидов<html> Подробно описаны в других разделах 23 . Данные, полученные в ходе наших текущих скрининговых исследований скрининга антител к гистону, использующих эту платформу массивов, архивируются на общедоступном веб-ресурсе, базе данных специфичности антител Histone (www.histoneantibodies.com). Примечательно, что гистоновые пептидные микрочипы, изготовленные с вариациями этого протокола, также широко использовались для характеристики активности досок 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 гистоновых ПТМ-считывателей для профилирования гистона Запись PTT и ластик 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Рисунок 1: Мультяшное изображение пошаговой процедуры скрининга антител на микрочипе гистонового пептида. Биотинилированные гистоновые пептиды, содержащие определенные посттрансляционные модификации (красные и синие круги), совместно печатаются с биотин-флуоресцеином на стекле, покрытом стрептавидином. Положительные взаимодействия визуализируются как красная флуоресценция. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Пост-трансляционные модификации (ПТМ) на белках гистонов широко изучены для их роли в регулировании структуры хроматина и экспрессии генов. Массовое производство и распределение антител, специфичных к ПТМ гистонов, значительно облегчило исследование этих признаков. Поскольку гистоновые ПТМ-антитела являются ключевыми реагентами для многих применений биохимии хроматина, необходим тщательный анализ специфичности антител для точной интерпретации данных и дальнейшего прогресса в этой области. Этот протокол описывает интегрированный конвейер для проектирования, изготовления и использования пептидных микрочипов для профилирования специфичности гистоновых антител. Аспекты дизайна и анализа этой процедуры облегчаются с помощью ArrayNinja, открытого программного обеспечения и интерактивного программного пакета, который мы недавно разработали для упрощения настройки форматов печати микрочипов. Этот конвейер использовался для скрининга большого количества коммерчески доступного и широко используемого гистонового PTM-антителаS, а данные, полученные в результате этих экспериментов, свободно доступны через онлайн-базу данных Спецификации антител Histone Antibody. Помимо гистонов, общая методика, описанная здесь, может быть широко применена для анализа специфичных к ПТМ антител.

Этот протокол использовался для разработки и изготовления платформы пептидного микрочипа для анализа специфичности антитела к гистону ПТМ. Массив запрашивает библиотеку из более чем 300 уникальных пептидных объектов (20-40 остатков в длину), представляющих многие изве?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами

В этой рукописи описаны методы применения пептидной микрочиповой технологии для профилирования специфичности антител, которые распознают гистоны и их посттрансляционные модификации.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Персонализированные пептид массивы для обнаружения Alloantibodies HLA в трансплантации

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Изоляция гистона от ткани листьев сорго для Top Down Масс Спектрометрия Профилирование потенциальных эпигенетических маркеров

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...