Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación Van Andel y una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (CA181343) a SBR

1. Instalación y ejecución de ArrayNinja <ol><li> Descargue e instale Oracle Virtual Box desde www.virtualbox.org. </li><li> Descargue y descomprima la máquina virtual ArrayNinja (VM) de http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Abra Virtual Box y agregue la VM ArrayNinja haciendo clic en &#39;Machine&#39;, &#39;Add&#39; y seleccione arrayninja.vbox en la carpeta donde se guardó VM ArrayNinja. </li><li> Inicie ArrayNinja seleccionándolo dentro de Virtual Box y haciendo clic en la flecha verde de inicio....

La fiabilidad de los anticuerpos en aplicaciones de investigación biomédica es fundamental 46 , 47 . Esto es especialmente cierto en la bioquímica de la cromatina dada la posición de los anticuerpos como herramientas clave para la mayoría de las técnicas desarrolladas para caracterizar la abundancia y distribución de histonas PTMs. El protocolo presentado aquí detalla un oleoducto optimizado para el diseño, fabricación y uso de microarrays de péptidos...

El ADN genómico se empaqueta elegantemente dentro del núcleo de la célula eucariota con proteínas histonas para formar cromatina. La subunidad de repetición de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pares de bases de ADN envueltas alrededor de un núcleo octameric de las proteínas histonas - H2A, H2B, H3 y H4 1 . La cromatina se organiza ampliamente en euchromatina libremente envasada y dominios de heterocromatina fuertemente envasados. El grado de compactación de la cromatina regula la medida en que las máquinas de proteínas pueden acceder al ADN subyacente para llevar a cabo procesos fundamentales basados ​​en el ADN, como la replicación, la transcripción y la reparación. Los reguladores clave de la accesibilidad del genoma en el contexto de la cromatina son PTMs en la cola no estructurada y los dominios centrales de las proteínas histonas 2 , 3 . Las PTM histonas funcionan directamente influyendo en la estructura de la cromatina 4 e indirectamenteH la contratación de proteínas lectoras y sus complejos macromoleculares asociados que tienen actividades de remodelación, enzimática y andamiaje de la cromatina 5 . Los estudios de la función PTM de las histonas durante las últimas dos décadas sugieren abrumadoramente que estas marcas juegan un papel clave en la regulación del destino celular, el desarrollo de organismos y la iniciación / progresión de la enfermedad. Impulsados ​​por los avances en espectrometría de masas basado en la tecnología proteómica, más de 20 único histone PTMs en más de 80 residuos distintos de histonas se han descubierto [ 6] . En particular, estas modificaciones a menudo se producen en combinaciones, y en consonancia con la hipótesis de &quot;código de histonas&quot;, numerosos estudios sugieren que las proteínas lectoras son dirigidas a regiones discretas de cromatina a través del reconocimiento de combinaciones específicas de histonas PTMs 7 , 8 , 9 . Un desafío clave para avanzar será la asignación de funciones al grDebido a la lista de histonas PTMs y para determinar cómo específicas combinaciones de histonas PTMs orquestar las funciones dinámicas asociadas con la cromatina. Los anticuerpos son los reactivos de la linterna para la detección de PTM histonas. Como tal, más de 1.000 histonas PTM anticuerpos específicos han sido comercialmente desarrollado para su uso en la investigación de la bioquímica de la cromatina. Con el rápido desarrollo de la tecnología de secuenciación de ADN de alto rendimiento, estos reactivos están siendo utilizados ampliamente por investigadores individuales y iniciativas epigenómicas a gran escala ( por ejemplo , ENCODE y BLUEPRINT) en ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina junto con secuenciación de próxima generación ) De tuberías para generar de alta resolución mapas espaciales de histonas PTM distribución de todo el genoma 10 , 11 . Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la especificidad de los anticuerpos PTM de las histonas puede ser altamente variable y que estos reactivos presentan<html> Las propiedades avorables tales como el reconocimiento de epítopos fuera de objetivo, la fuerte influencia positiva y negativa por PTMs vecinas y la dificultad para discriminar la orden de modificación en un residuo particular ( por ejemplo , mono-, di- o trimetil-lisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Por lo tanto, es necesario un riguroso control de calidad de los reactivos de anticuerpos específicos de histonas PTM para interpretar con precisión los datos generados con estos valiosos reactivos. La tecnología de microarray permite la interrogación simultánea de miles de interacciones macromoleculares en un formato de alto rendimiento, reproducible y miniaturizado. Por esta razón, una variedad de plataformas de microarrays se han creado para analizar la proteína-ADN 19 ,20, la proteína-proteína 21 , y las interacciones proteína-péptido 22. De hecho, los microarrays de péptidos histona han surgido como una plataforma de descubrimiento informativo para la investigación de la bioquímica de la cromatina, permitiendo el perfilado de alto rendimiento de los escritores, borradores y lectores de histonas PTMs 15 , 23, 24, y también para el análisis de la especificidad del anticuerpo de histona 17, 25. más allá de su aplicación en la cromatina y la epigenética investigación, las matrices de péptidos de histona tienen utilidad potencial como una prueba de diagnóstico / pronóstico para el lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades autoinmunes donde anti- Se generan autoanticuerpos de cromatina 26 , 27 . Aquí, describimos una tubería integrada que hemos desarrollado para diseñar, fabricar yPara generar perfiles de especificidad para anticuerpos que reconocen las histonas y sus PTMs. El pipeline es facilitado por ArrayNinja, una aplicación de código abierto de software interactivo que recientemente desarrollamos, que integra las etapas de diseño y análisis de los experimentos con microarrays [ 28] . ArrayNinja funciona mejor en Google Chrome. En resumen, se utiliza una impresora de microarrays de contacto robótico para depositar una biblioteca de péptidos de histona conjugados con biotina en posiciones definidas en portaobjetos de microscopio de vidrio revestidos con estreptavidina. Las matrices se pueden utilizar entonces en un formato de ensayo competitivo y paralelo para interrogar las interacciones anticuerpo-epítopo ( Figura 1 ). La biblioteca de péptidos consiste en cientos de péptidos sintéticos únicos que albergan PTMs (acetilación de lisina, metilación de lisina / arginina y fosforilación serina / treonina) solos y en combinaciones relevantes derivadas en gran medida de conjuntos de datos proteómicos. Métodos de síntesis y validación de péptidos<html> Se detallan en otra parte 23 . Los datos generados a partir de nuestros esfuerzos de detección de anticuerpos PTM de histonas en curso que utilizan esta plataforma de matriz se archivan en un recurso público de la web, la Base de datos de especificidad de anticuerpos de histonas (www.histoneantibodies.com). En particular, los microarrays de péptidos de histona fabricados con variaciones de este protocolo también se han utilizado ampliamente para caracterizar la actividad de los dominios de lectores de PTM de histonas 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 y más recientemente a histona de perfil Actividades de escritor y borrador de PTM 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Representación de dibujos animados del procedimiento escalonado para la detección de anticuerpos en un microarray de péptidos histona. Los péptidos de histona biotinilados que albergan modificaciones postraduccionales definidas (círculos rojos y azules) se co-imprimen con biotina-fluoresceína sobre vidrio revestido con estreptavidina. Las interacciones positivas se visualizan como fluorescencia roja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Las modificaciones postraduccionales (PTMs) en las proteínas histonas son ampliamente estudiadas por sus papeles en la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica. La producción en masa y la distribución de anticuerpos específicos de histonas PTMs ha facilitado enormemente la investigación sobre estas marcas. Como los anticuerpos histónicos PTM son reactivos clave para muchas aplicaciones de bioquímica de la cromatina, es necesario un análisis riguroso de la especificidad del anticuerpo para una interpretación precisa de los datos y un progreso continuo en el campo. Este protocolo describe una tubería integrada para el diseño, fabricación y uso de microarrays peptídicos para perfilar la especificidad de los anticuerpos histona. Los aspectos de diseño y análisis de este procedimiento son facilitados por ArrayNinja, un paquete de software interactivo y de código abierto que recientemente desarrollamos para simplificar la personalización de los formatos de impresión en microarrays. Este gasoducto se ha utilizado para examinar un gran número de anticonceptivos de histonas PTM comercialmente disponibles y ampliamente utilizadosS, y los datos generados a partir de estos experimentos están disponibles gratuitamente a través de una base de datos en línea y en expansión Histone Antibody Specificity. Más allá de las histonas, la metodología general aquí descrita puede aplicarse ampliamente al análisis de anticuerpos específicos de PTM.

Este protocolo se ha utilizado para diseñar y fabricar una plataforma de microarrays de péptidos para el análisis de la especificidad de anticuerpos histona PTM. El array consulta una biblioteca de más de 300 características únicas de péptidos (20 - 40 residuos de longitud) que representan muchas de las combinaciones conocidas de PTMs que se encuentran en el núcleo y la variante de las proteínas histonas [ 38] . Este gasoducto ha sido un caballo de batall...

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Este manuscrito describe métodos para aplicar la tecnología de microarrays de péptidos a la especificidad de perfiles de anticuerpos que reconocen las histonas y sus modificaciones post-traduccionales.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

The goal of this video is to describe an integrated pipeline for the design fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificities of histone antibodies. Antibodies that recognize histones and their diverse post-translational modifications are key reagents in chromatin biochemistry research. We rely on these tools to deepen our understanding of histone modification function.Recent studies reveal inconsistencies in histone antibody behavior. As antibody choice is the most critical element in epigenetics experiments, vigorous incomprehensive quality control measures are demanded for these reagents. Here, we demonstrate an integrated pipeline we'd developed for designing, fabricating and analyzing peptide microarrays to generate specificity profiles for antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.The pipeline is facilitated by Array Ninja, an open source interactive software application that we developed, which integrates the design and analysis stages of microarray experiments. To begin designing the array slide, under the plan a slide layout heading, select the microarray printer that will be used. Then, type, empty in the load plate field and press enter.Set the spot diameter to 275 micrometers and the spot spacing to 100 micrometers. Fill in the remaining parameters appropriately for the experiment, ensuring that the layout allows for sufficient replicates. At the resulting layout preview, mouse over each unique peptide feature on the slide and enter a feature identifier in the popup text box.Once each unique feature has been labeled, click populate. Name the slide layout, and click commit your plate to save the layout and generate a map at the physical locations of each feature in the source plates. Guided by the source plate map, load one to two microliters of each peptide feature into the designated wells of one or more 384 wells, small volume plates, dilute each feature 10 fold with 1x protein microarray printing buffer, supplemented with 1%bovine serum albumin and five micrograms per microliter fluorescin labeled biotin.Then, centrifuge the plates at 500 x G at room temperature for two minutes. Next, empty the waste container at the microarray printer. Fill the washed solution in humidifier containers with sterile distilled water.Enter the array slide parameters in the microarray printer software. Set the washing procedure to a one second wash with the single immersion, the post washed to redip the pins five times, and the humidity to 60%Then, insert encoated glass slides into the substrate platinums. Load the platinums into the platinum elevator.Insert the source plates into the plate holders and load the holders into the source plate elevator. Run the printing process, then, remove the substrate platinums from the instrument. Block the printed slides with 1x protein microarray blocking buffer for 30 minutes while shaking.Then, wash the slides in room temperature, pH 7.6 phosphate buffered saline for 10 minutes. Repeat the wash with a fresh batch of PBS. Dry the slides by centrifugation for 30 seconds at room temperature.Next, pre-heat a microarray wax imprinter at 85 degrees celsius for 30 minutes, or until the wax has melted. Then, insert a slide printed side down, into the holder and align the holder with the imprinter mold. Bring the mold into contact with the slide and hold for two seconds, then, quickly remove the slide from the holder and inspect the wax borders to verify that the arrays are properly enclosed.Store the partitioned slides at four degrees celsius, in a dry dark area. To begin the hybridization procedure, place a partitioned array slide in a plastic dish and cover the slide with hybridization buffer. Equilibrate the slide for 30 minutes at four degree celsius, while shaking at low speed.Dry the slide by spinning in a microarray slide centrifuge at room temperature. Then, add five microliters of each histone PTM antibody solution to at least two wells of the array and incubate at four degree celsius for one hour. Following incubation, remove the antibody solution and wash the array with cold PBS three times for five minutes each at four degrees celsius.Next, incubate the array in a fluorescent dye-conjugated secondary antibody solution. For 30 minutes at four degrees celsius, in the absence of light. Wash the slide three times with cold PBS as before.Dip the array in room temperature 0.1x PBS to remove excess salt and dry the slide by brief centrifugation at room temperature. Image the slide with a microarray scanner at a resolution of at least, 25 microns. To begin the analysis, use image processing software to merge the single channel files from the microarray scanner.Then, open Array Ninja and select the appropriate microarray printer under the, to quantify images header. Fill in the name of the same slide layout in the load plate dialog box, and press enter. Load the merged image file, and adjust the contrast, brightness and mid point as desired.Fill in the array scanner resolution, adjust the top and side margins to align slide layout grid with the image. To analyze a set of wells as replicates or perform other selective analysis, fill in the well coordinates in the iPin, jPin, and subA fields and press enter. Click to toggle zoom, to display a magnified image of the area under the cursor.Then, click spot seek and wait for the process to finish. Repeat the seek function as needed to center the grid circles on the array spots. Reference spots can be selected by pressing the R key and spot showing debris or widely bearing morphology can be deactivated by pressing the A key while hovering over the spot.Once the background reference spots have been selected, and spots with pore morphology or contamination have been deactivated, click populate, followed by, submit to perform the quantification. A bar graph and table will be displayed in a new page. The binding specificities of two histone PTM antibodies were evaluated using this method.A histone PTM antibody designed to target trimethylated lysine 9 on histone H3 was also found to bind to three other trimethylated lysine groups. A silylation of neighboring lysine residues was observed to positively influence targeting of lysine 9 on H3.A histone PTM antibody targeting trimethylated lysine 4 on histone H3, was found to interact with singlely methylated and dimethylated lysine 4 on H3 as well. Phosphorelation of the neighboring three anine six, was observed to negatively impact binding at lysine four in this assay.This pipeline has been used to screen many of the most widely used, commercially available histone antibodies and data generated from these experiments is freely available through the histone antibody specificity database. Variations to this pipeline have been previously described for the analysis of histone readers, writers and erasers, modifying this platform before utility beyond epigenetics research could be easily for any printable library of interest. Several histone peptide microarray platforms are available commercially for users who do not have access to the specialized equipment needed to synthesize peptides and fabricate arrays.

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