Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av Van Andel Research Institute och ett forskningsbidrag från National Institutes of Health (CA181343) till SBR

1. Installera och köra ArrayNinja <ol><li> Hämta och installera Oracle Virtual Box från www.virtualbox.org. </li><li> Hämta och komprimera ArrayNinja virtuella maskin (VM) från http://research.vai.org/Tools/arrayninja. </li><li> Öppna Virtual Box och lägg till ArrayNinja VM genom att klicka på &quot;Maskin&quot;, &quot;Lägg till&quot; och välj arrayninja.vbox från mappen där ArrayNinja VM har sparats. </li><li> Starta ArrayNinja genom att välja den i Virtual Box och klicka på den gröna &quot;start&quot;...

Antikroppsäkerhet i biomedicinska forskningsapplikationer är viktigast 46 , 47 . Detta gäller speciellt vid kromatinbiokemi med antistoffpositioner som viktiga verktyg för de flesta tekniker som utvecklats för att karakterisera överflöd och fördelning av histon-PTM. Protokollet presenterade här en optimerad pipeline för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för att analysera histon PTM-antikroppsspecificitet. Denna rörlednin...

Genomiskt DNA packas elegant inuti den eukaryota cellkärnan med histonproteiner för att bilda kromatin. Den repeterande subenheten av kromatin är nukleosomen, som består av 147 baspar av DNA lindade runt en oktamert kärna av histonproteiner - H2A, H2B, H3 och H4 1. Kromatin är brett organiserad i löst packade eukromatin och tätt packade heterochromatindomäner. Graden av kromatinkomprimering reglerar i vilken utsträckning vilka proteinmaskiner kan komma åt det underliggande DNA för att utföra grundläggande DNA-templerade processer såsom replikation, transkription och reparation. Huvudregulatorer av genomtillgänglighet i samband med kromatin är PTM på de ostrukturerade svans- och kärndomänerna hos histonproteinerna 2 , 3 . Histon PTMs fungerar direkt genom att påverka strukturen hos kromatin 4 och indirektH rekryteringen av läseproteiner och deras associerade makromolekylära komplex som har kromatinkonstruktion, enzymatisk och ställningsaktiviteter 5 . Studier av histon PTM-funktion under de senaste två decennierna föreslår överväldigande dessa märken spelar nyckelroller för att reglera celllina, organismutveckling och sjukdomsinitiering / progression. Fueled av framsteg i masspektrometribaserad proteomteknik har mer än 20 unika histon-PTM på mer än 80 olika histonrester upptäckts 6 . I synnerhet förekommer dessa modifieringar ofta i kombinationer och i överensstämmelse med &quot;histon-kod&quot; -hypotesen, visar många studier att läsareproteiner är riktade mot diskreta områden av kromatin genom igenkänning av specifika kombinationer av histon PTMs 7 , 8 , 9 . En viktig utmaning framöver är att tilldela funktioner till grPå grund av en lista över histon PTM och för att bestämma hur specifika kombinationer av histon PTM orkestrerar de dynamiska funktionerna som är associerade med kromatin. Antikroppar är lynchpinreagenserna för detektering av histon-PTM. Som sådan har mer än 1000 histon-PTM-specifika antikroppar utvecklats kommersiellt för användning vid kromatisk biokemiforskning. Med den snabba utvecklingen av DNA-sekvenseringsteknologi med hög genomströmning används dessa reagenser i stor utsträckning av enskilda utredare och storskaliga epigenomiska &quot;roadmap&quot; -initiativ ( t.ex. ENCODE och BLUEPRINT) i ChIP-seq (kromatinimmunutfällning kopplad till nästa generations sekvensering ) Rörledningar för att generera högupplösande rumsliga kartor över histon-PTM-fördelningsgenombrett 10 , 11 . Nya studier har dock visat att specificiteten hos histon-PTM-antikroppar kan vara mycket variabel och att dessa reagenser uppvisar oförmåga<html> Skäliga egenskaper som off-target-epitopigenkänning, starkt positivt och negativt inflytande av närliggande PTM, och svårigheter att diskriminera modifieringsordningen på en viss rest ( t.ex. mono-, di- eller tri-metyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Därför är en stringent kvalitetskontroll av histon PTM-specifika antikroppreagens nödvändiga för att noggrant tolka data som genereras med dessa värdefulla reagens. Microarray-teknik möjliggör samtidig utfrågning av tusentals makromolekylära interaktioner i ett genomskinligt, reproducerbart och miniatyriserat format. Av denna anledning har en mängd olika mikroarrayplattformar skapats för att analysera protein-DNA 19 ,&quot;&gt; 20, proteinprotein 21 och proteinpeptid-interaktioner 22. I själva verket har histonpeptidmikrorays uppstått som en informativ upptäcktsplattform för kromatinbiokemiforskning, vilket möjliggör hög genomströmningsprofilering av författarna, raderarna och läsarna av histon PTM 15 , 23, 24, och även för analys av histon antikroppsspecificitet 17, 25. Utöver deras tillämpning i kromatin och epigenetik forskning, histon peptid arrayer har potentiell användbarhet som ett diagnostiskt / prognostiskt test för systemisk lupus erythematosus och andra autoimmuna sjukdomar där anti- Kromatin-autoantikroppar genereras 26 , 27 . Här beskriver vi en integrerad pipeline som vi har utvecklat för att designa, tillverka och queRita histonpeptidmikroarrays för att generera specificitetsprofiler för antikroppar som känner igen histoner och deras PTM. Ledningen underlättas av ArrayNinja, en öppen källkod, interaktiv programvara som vi nyligen utvecklat, vilket integrerar design och analysstadier av mikroarray-experiment 28 . ArrayNinja fungerar bäst i Google Chrome. I korthet används en robotkontakt-mikroarrayskrivare för att deponera ett bibliotek av biotinkonjugerade histonpeptider vid definierade positioner på streptavidinbelagda glasmikroskopskivor. Arrays kan sedan användas i ett kompetitivt och parallellt analysformat för att förhöra antikropp-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består av hundratals unika syntetiska peptider som innehåller PTM (lysinacetylering, lysin / argininmetylering och serin / treoninfosforylering) ensam och i relevanta kombinationer som i stor utsträckning härstammar från proteomikdataset. Metoder för peptidsyntes och validering<html> Beskrivs annorstädes 23 . Data som genereras av våra pågående histon-PTM-antikroppsskärmningsansträngningar som utnyttjar denna arrayplattform arkiveras på en offentlig webbresurs, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). I synnerhet har histonpeptidmikroarrays tillverkad med variationer av detta protokoll också använts i stor utsträckning för att karakterisera aktiviteten hos histon-PTM-läsarens domäner 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 och mer nyligen för att profilera histon PTM-författare och suddgummi 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Tecknadspåvisning av stegvis procedur för antikroppsscreening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerade histonpeptider som innehåller definierade posttranslationella modifieringar (röda och blå cirklar) trycks med biotin-fluorescein på streptavidinbelagd glas. Positiva interaktioner visualiseras som röd fluorescens. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

Post-translationella modifieringar (PTM) på histonproteiner studeras allmänt för sina roller vid reglering av kromatinstruktur och genuttryck. Massproduktionen och distributionen av antikroppar specifika för histon PTM har underlättat forskning på dessa märken. Eftersom histon-PTM-antikroppar är nyckelreagenser för många kromatinbiokemiapplikationer är rigorös analys av antikroppsspecificitet nödvändig för noggrann datatolkning och fortsatta framsteg inom området. Detta protokoll beskriver en integrerad rörledning för konstruktion, tillverkning och användning av peptidmikroarrays för profilering av specificiteten hos histonantikroppar. Design och analys aspekter av detta förfarande underlättas av ArrayNinja, ett open source och interaktivt mjukvarupaket som vi nyligen utvecklat för att effektivisera anpassningen av microarray-utskriftsformat. Denna rörledning har använts för att skärpa ett stort antal kommersiellt tillgängliga och allmänt använda histon PTM-antikropparS, och data som genereras från dessa experiment är fritt tillgängliga genom en online och expanderande Histone Antibody Specificity Database. Utöver histoner kan den allmänna metod som beskrivs häri appliceras i stor utsträckning till analysen av PTM-specifika antikroppar.

Detta protokoll har använts för att designa och tillverka en peptidmikroarrayplattform för analys av histon-PTM-antikroppsspecificitet. Arrayet frågar ett bibliotek med mer än 300 unika peptidfunktioner (20-40 rester i längd) som representerar många av de kända kombinationerna av PTM som finns på kärn- och varianthistonproteiner 38 . Denna rörledning har varit en arbetshorse för screening av många allmänt använda och kommersiellt tillgängliga histo...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Detta manuskript beskriver metoder för tillämpning av peptidmikroarray-teknik för specificitetsprofilering av antikroppar som känner igen histoner och deras posttranslationella modifikationer.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion och rening av en terapeutisk antikropp

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personlig peptid matriser för detektion av HLA alloantikroppar vid organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering av histon från Sorghum Leaf Tissue för top down masspektrometriprofilering av potentiella epigenetiska markörer

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...