Name: isolation of human myoblasts, assessment of myogenic differentiation, and store-operated calcium entry measurement
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00
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यह काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030-166313), &quot;फोंडेशन सुइस डेल ला रिफेर्क ला लेस मेलैडीज मस्क्यूलायर्स&quot;, &quot;फाउंडेशन मार्सेल लेविल्लंत&quot; और &quot;फोंडेशन डेल ला रिकरके ओस्टियो-आर्टिकुलायर&quot; द्वारा किया गया था।

मानव मांसपेशियों के नमूनों (अर्धसैनिक मांसपेशियों से प्राप्त ऊतक) स्वस्थ रोगियों के दौरान आर्थोपेडिक सर्जरी के दौरान सर्जिकल कचरे के रूप में एकत्र किए गए थे। मानव अध्ययन से जुड़े सभी तरीकों स्विस वि?...

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	<li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration.">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skeletal+muscle+stem+cells.">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li><li>Chen, W. 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R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2++release.">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li><li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER.">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2+-sensitive+fluorescent+proteins.">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li></ol>

वयस्क कंकाल की मांसपेशियों से मानव मैबोलास्ट्स का अलगाव और संस्कृति पेशी विभेद और मांसपेशियों के उत्थान के अध्ययन के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करता है। इस पत्र में, हम एक प्रोटोकॉल प्र?...

मानव कंक्रीट की मांसपेशियों में संक्रमित समूहों के समूह होते हैं, बहु-केन्द्रित मांसपेशियों के फाइबर्स जिसके परिणामस्वरूप मायोजेनिक पूर्ववर्ती कोशिकाओं के संलयन होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों में अनुसूचित जाति की मौजूदगी के लिए चोट के बाद पुनर्जन्म होने की क्षमता है, कंफ़्टरल पेशी स्टेम कोशिकाएं जो मायोफिबर (सरकोलेमा) और बेसल लैमिना के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित होती हैं। निर्जीव मांसपेशी में, अनुसूचित जातियों ज्यादातर मौन राज्य में मौजूद हैं। यांत्रिक तनाव या चोट के जवाब में, अनुसूचित जातियों को सक्रिय (मायोब्लास्ट) बन जाते हैं, पैदा होते हैं, और एसआईसी पूल 1 , 2 को फिर से भरने के लिए नए मायोफिबर या आत्म-नवीकरण करने के लिए भेदभाव से गुजरती हैं। इन वर्षों में, अनुसूचित जातियों और उनकी संतान, म्यॉब्लास्ट को कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से अलग करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था। कोशिका की सतह के मार्करों की अधिक समझ के साथ इन कोशिकाओं और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 3 की पद्धति पर व्यक्त की गई, 4 , 5 , अब मांसपेशियों के नमूनों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध आबादी को अलग करना संभव है। कैल्शियम सिग्नलिंग कंकाल की मांसपेशियों के विकास, होमोस्टैसिस और पुनर्जनन को नियंत्रित करती है। विशेष रूप से, सीए 2 + एंट्री जो इंट्रासेल्युलर स्टोर कम करने के बाद सक्रिय होती है, जिसे एसओसीई कहा जाता है, इन प्रक्रियाओं के लिए बहुत महत्व 6 है। सेल उत्तेजना पर, एंडो / सर्पोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) में सीए 2 + स्तर कम हो जाता है, जो बदले में प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल सक्रिय करता है जो ईआर / एसआर 7 को फिर से भरने के लिए Ca 2+ एंट्री की अनुमति देता है। एसओसीई में शामिल दो मुख्य प्रोटीन ईआर / एसआर सीए 2+ हैं - स्ट्रॉमल इंटरैक्शन अणु 1 (एसटीआईएम 1) प्रोटीन और प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल ओराई 1। कंकाल की मांसपेशियों में इन दोनों प्रोटीन, साथ ही एक ही परिवार के अन्य प्रोटीन (एसटीआईएम 2 एएनडी ओराई 2-ओराई 3) 8 , 9 और कई सीए 2+ -अभिव्यक रिसेप्टर संभावित कैनोनिकल (टीआरपीसी) परिवार 10 , 11 , 12 , 13 के पारगम्य चैनल। एसओईई मार्ग के माध्यम से सीए 2+ एंट्री मांसपेशियों के गठन / उत्थान 14 के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। एसटीआईएम 1 या ओराई 1 प्रोटीन का म्यूटेशन मांसपेशी समारोह पर हानिकारक प्रभाव है, मुख्य रूप से पेशी हाइपोटोनिया 15 के लिए अग्रणी है। एसओसीई हानि के साथ पशु मॉडल भी मांसपेशियों और बल को कम करते हैं, साथ में बढ़ी हुई थकावट 6 , 16 , 17 के साथ । जैसा कि उल्लेख किया गया है, अन्य एसटीआईएम और ओराई प्रोटीन, साथ ही साथ कई टीआरपीसी चैनल, कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त हैं, और उनकी भूमिकाएं अब तक निर्धारित नहीं की गई हैं। घ दस्तक करकेअपनी अभिव्यक्ति के स्तर का मालिक है, इसलिए एसओसीई में उनके निहितार्थ की जांच करना संभव है और मानवीय कंकाल की मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान उनकी भूमिकाएं हैं। एसईसीई माप दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग कर किया जा सकता है: इलेक्ट्रोफिज़ियोलॉजिकल वर्तमान रिकॉर्डिंग और सीए 2+ मापन। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी निश्चित रूप से एक अधिक प्रत्यक्ष पद्धति है, क्योंकि यह ब्याज की वर्तमान और उसके संबंधित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल हस्ताक्षर को मापता है। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं पर इस तकनीक को लागू करना बहुत मुश्किल है, मुख्य रूप से मांसपेशी कोशिकाओं के बड़े आकार और अंतर्जात SOCE वर्तमान के छोटे आकार के कारण। साइटोसोलिक सीए 2 + इमेजिंग तकनीकी रूप से बहुत पहुँचा जा सकता है, लेकिन उपाय, अधिक अप्रत्यक्ष है के रूप में सीए 2 + स्तर साइटोसोल में मापा दोनों सीए के प्रवेश 2 + और फिर से पम्पिंग सेल से बाहर या आंतरिक दुकानों में दर्शाता है। एक कार्यप्रणाली जिसमें मायब्ल्लास्ट्स को मानव स्केले के छोटे टुकड़ों से अलग करना शामिल हैइस पत्र में एंजाइमिक पाचन, प्रवर्धन, और एफएसीएस के बाद एटियल मांसपेशियों को समझाया गया है। समय के साथ भेदभाव के मार्करों की अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए मांसपेशियों के भेदभाव की प्रक्रिया और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 18 को वर्णित किया गया है। अंत में, एसओईसी की माप और सीए 2+ सिग्नलिंग और कंकाल की मांसपेशी विभेद में अलग-अलग आयन चैनलों की भूमिका को समझाया गया है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Ham&#8217;s F10</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">31550-023</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">FCS</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">10270-106</td>
			<td style="width:201px;">Lot 41G5532K</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">BSA</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">O5482</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">fetuin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">F3385</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">EGF</td>
			<td style="width:235px;">Corning</td>
			<td style="width:187px;">354001</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Dexamethansone</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">D1756</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Insulin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">I9278</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Creatine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">27900</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Pyruvate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">P4562</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Uridine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">U3003</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">15710-049</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">25300-062</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352350</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352340</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 50&#160;ml tube</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352070</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 15&#160;ml tube</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352096</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 5&#160;ml tube (FACS)</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352058</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Culture medium: OPTI-MEM</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">31985-047</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Transfectant reagnt: RNAiMax</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">1756064</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">14190-094</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:235px;">Fluka</td>
			<td style="width:187px;">10981</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti-MyHC *</td>
			<td style="width:235px;">DSHB</td>
			<td style="width:187px;">MF20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti-myogenin</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:187px;">556358</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Rabbit anti-MEF2</td>
			<td style="width:235px;">Santa Cruz Biotech</td>
			<td style="width:187px;">C-21</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">A11029</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Goat anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">A11035</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD56-Alexa488</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557699</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD146-PECy7</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562135</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD45-PE-CF594</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562279</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD34-APC</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">345804</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD144-PE</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">560410</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Alexa Fluor 488 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557702</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PECy7 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557872</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PE-CF594 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562292</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">APC mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">550854</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PE mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">556650</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">DAPI</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">D9542</td>
			<td style="width:201px;">CAUTION:&#160; toxic compound</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fluka</td>
			<td style="width:187px;">762400</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">F1201</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">P3000MP</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">T9033</td>
			<td style="width:201px;">CAUTION&#160;: toxic compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3</td>
			<td style="width:235px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;">*&#160;: MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human myoblasts, assessment of myogenic differentiation, and store-operated calcium entry measurement

उपग्रह कोशिकाएं (एससी) मांसपेशी तंतुओं के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं और आसपास के बेसल लैमिना हैं। वे मांसपेशियों के उत्थान के लिए आवश्यक हैं चोट पर, जो कंकाल की मांसपेशियों में अक्सर होता है, अनुसूचित जाति सक्रिय होते हैं। वे म्यॉब्लास्ट के रूप में फैल जाते हैं और मांसपेशियों के घावों की मरम्मत के लिए अंतर करते हैं। मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान होने वाली कई घटनाओं में, साइटोसोलिक सीए 2 + सिग्नल बहुत महत्वपूर्ण हैं। इन सीए 2 + सिग्नल सीए 2+ से आंतरिक सीए -2+ स्टोर्स से रिलीज हो सकते हैं, साथ ही बाह्य अंतरिक्ष से सीए 2+ एंट्री से, विशेष रूप से दुकान संचालित सीए 2 + एंट्री (एसओसीई) से उठता है। यह पेपर अस्थि-चिकित्सा सर्जरी के बाद एकत्र हुए मांसपेशियों के नमूनों से मानव मैबोलास्ट की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली एक पद्धति का वर्णन करता है। ऊतक यंत्रवत् और एंजाइमिक रूप से पच जाता है, और कोशिकाओं को विस्तारित किया जाता है और फिर विशिष्टता की उपस्थिति के अनुसार प्रवाह cytometry द्वारा क्रमबद्ध किया जाता हैफिक झिल्ली मार्कर एक बार प्राप्त होने पर, संस्कृति के माध्यम से विकास के कारकों को हटाकर मानव म्यॉब्लास्ट का विस्तार किया जाता है और विभेद करने के लिए प्रतिबद्ध है। विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों और इन विट्रो इम्युनोफ्लोरेसेंस के अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग नियंत्रण परिस्थितियों में मायोजेनिक भेदभाव प्रक्रिया का आकलन करने के लिए किया जाता है और सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल होने वाले प्रोलीन प्रोटीन के बाद किया जाता है। अंत में, हम फ्यूरा -2 के उपयोग को रातिओमेट्रिक सीए 2+ जांच के रूप में विस्तारित करते हैं जो SOCE के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप प्रदान करता है।

मानव मांसपेशियों के नमूने के एंजाइमिक पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं को जीएम में बढ़ा दिया गया। मानव myoblasts, CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- कोशिकाओं के रूप में परिभाषित, एफएसीएस के बाद प्राप्त किए गए थे। Myoblasts विश्लेषण जनसंख्?...

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Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

यहां, हम वयस्क मांसपेशियों के ऊतकों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो कंकाल की मांसपेशी विभेद में अध्ययन करने के लिए किया जाता है, और विशेषकर, सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए।

मानव माइॉब्लास्ट्स अलगाव, मायाजक विभेदन का आकलन और स्टोर-संचालित कैल्शियम एंट्री मापन

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

The overall goal of this procedure is to obtain a pure population of human myoblasts from adult skeletal muscle. These cells are used for functional studies such as assessment of myogenic differentiation and measurement of store-operated calcium entry. The main advantage of this technique is that it allows a rapid, simple and reproducible isolation of human primary myoblasts.These myoblasts are the new ex-vivo to study the calcium signaling during muscle regeneration. This method can help answer key questions in the muscle field such as, identifying the ionic channels and the transcription factors involved during muscle differentiation. For this method can provide insight into gene functions during human myogenic differentiation.It can also be applied to other studies such as, potential for using myogenic stem cells to treat muscular dystrophies. Transfer the muscle sample into a sterile six centimeter plate, wash the sample with PBS twice. Remove any remaining adipose tissue and weigh the sample.Next, add trypsin and mince the muscle into pieces smaller than two millimeters in size. Once minced, use a 10 milliliter pipette to transfer the tissue into a 200 milliliter dissociation bottle containing a stir bar, then continue collecting minced tissue in trypsin solution until the dissociation bottle is filled to 90 milliliters. Now, incubate the tissue in a water bath at 37 degrees celsius for 60 minutes with gentle stirring.After an hour, add 10 milliliters of FCS to stop the reaction and homogenize the mixture using trituration. Now, load 70 micron strainers onto two 50 milliliter tubes and pass half of the cell suspension through each strainer by pipetting the suspension into the filters. Next, make a suspension of the cells in growth medium and plate 200, 000 cells onto six centimeter plates with four milliliters of medium.Incubate the plates, changing the medium every third day. After five to seven days, the cells should be 70%to 80%confluent, then, stain them. To begin, rinse the plate of confluent cells with PBS.Then, add one milliliter of trypsin solution and let the enzyme work for three minutes. Stop the reaction by adding two milliliters of medium and collect the cells in a 15 milliliter tube. Then, spin the cells down and re-suspend them in one milliliter of medium.Next, take a cell count while storing the cells on ice. For the facts analysis, load seven tubes with 100, 000 cells each. Load the remaining cells into an eighth tube for sorting.Wash the cells with one milliliter of cold fax buffer, then, centrifuge the tubes and aspirate and discard the supernatant. Add back 200 microliters of fax buffer with the appropriate antibodies and let the cells incubate on ice for 30 minutes. After 30 minutes, wash the cells again and re-suspend them in 500 microliters of fax buffer, then sort the cells using a flow cytometer.After excluding the CD45 positive hematopoietic cells, separate the CD45 negative cells based on CD56 expression. Then, gate the CD56 positive population for CD34, CD144 and CD146. Re-analyse a fraction of the sorted population, to check the purity.Now, pull the human myoblasts and wash them with five milliliters of medium. Then re-suspend them in one milliliter of medium. Transfer the suspension to a six centimeter plate with four milliliters of medium and incubate the plate at 37 degrees celsius with 7%carbon dioxide.For this procedure, have cultured myoblasts and make fresh transvection medium. Incubate the medium at room temperature for 15 to 20 minutes. During the medium incubation, prepare the myoblasts.First, rinse them once with PBS. Then, trypsinise the adherent cells. Stop the reaction by adding two milliliters of medium.Then, collection the cells into a 50 milliliter tube. Spin them down and re-suspend them in one milliliter of medium. For each transvection, prepare 500, 000 cells in 200 microliters of medium.To each 500 microliters of transvection medium, add a 200 microliter aliquot of cells and then mix using only two strokes of the pipette gun. Then, let the reactions proceed for five minutes at room temperature. After five minutes, transfer the reactions to 3.5 centimeter culture dishes, each containing one glass cover slip.Next, add 1.3 milliliters of medium for a final volume of two milliliters and incubate the dishes. After 48 hours of differentiation, the cells can be immunostained or analyzed using calcium imaging. For either option, first carefully wash the cells twice using one milliliter of room temperature PBS to wash.Try to avoid detaching the myotubes. For a calcium imaging, cover the washed cells with two micromolar fura-2 AM plus one micromolar threonic acid in calcium containing medium. Then, let them incubate for about 30 minutes before mixing.Next, wash the cells twice with unmodified calcium containing medium and then, incubate them for 10 to 15 minutes for the esterification. Now, remove the cover slip from a culture plate and install it into the experimental chamber. Load the chamber with calcium containing medium, place it under a microscope, then, start the data recording.Fura-2 is excited alternately at 340 and 380 nanometers. The emission light is collected at 510 nanometers. Diving the 340 nanometer nanometer images by the 380 images, provides the image ratios as the fluctuations and calcium concentration are relatively low, acquire one image ratio every two seconds.After two or three minutes, replace the medium with calcium free medium. Then, for one or two minutes, monitor the activity of the store operated calcium in the cells. Next, add one micromolar thapsigargin to the cells to deplete their internal calcium stores.Wait eight to 10 minutes, then, rapidly replace the medium with the calcium containing medium and record for five minutes while calcium enters the cells via the suc e channels. After terminating the experiment, analyze the images. Select an area where there are no cells for region one, which defines the background, then, select an area in the cytoplasm for region two.The two regions can be drawn on any of the images in the series. Next, go to the run experiments tab and select reference images for the 340 and 380 channels, select region one, then click on subtract background. Now, run the entire experiment to remove the background from all the images.Once completed, click log data option to open a spreadsheet in which the time and the ratio data are logged. Muscle cells were grown up, expanded and sorted using fax. Myoblasts represented more than 60%of the analyzed population.The primary human myoblasts were then cultured in differentiation medium and immunostained for the transcription factor of MEF2 and myosin heavy chain proteins. A majority of cells expressed myosin heavy chain and formed myotubes with fusion index values of about 60%the other 40%of the cells remained undifferentiated mononucleated cells, also known as reserve cells. The described store operated calcium entry experiment were successfully performed on the differentiated cells.Performing the same experiment to on cells transvected with small interfering RNA, directed against calcium permeable channels of the TRPC family, shows that the knockdown had a measurable impact on store operated calcium entry. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate human myoblasts from adult skeletal muscle. We use these cells to study the successive steps of muscle differentiation and in particular, deactivation of the transcription factors and calcium channels.Once mastered, this technique can be done in less than three hours if it is performed properly. It is a rapid, simple, reproducible method that obtains the yield of human myoblasts. While attempting this procedure, it is important to prevent the myoblast cultures from reaching full confidence, as there will be unwanted spontaneous differentiation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राथमिक myogenic कोशिकाओं और fibroblasts के अलगाव और मात्रात्मक Immunocytochemical विशेषता

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

एसएच SY5Y मानव neuroblastoma सेल लाइन के भेदभाव

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

अलगाव और वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव सुअर चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

तैयारी और प्रौढ़ और वृद्ध मनुष्यों के कंकाल की मांसपेशी से Myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं / प्राथमिक myoblasts की संस्कृति

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

अलगाव, संस्कृति, और चूहों से अस्थि मज्जा Stromal कोशिकाओं और अस्थिशोषक Progenitors के भेदभाव

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

अलगाव, प्रचार, और मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के Neuronal भेदभाव के दौरान Prion प्रोटीन अभिव्यक्ति

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...