Name: retroviral scanning: mapping mlv integration sites to define cell-specific regulatory regions
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Европейского исследовательского совета (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), итальянского министерства образования, университетов и исследований (FIRB-Futuro в Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro в Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , Флагманский проект EPIGEN Epigenomics), Министерство здравоохранения Италии (Молодые исследователи Call 2011 GR-2011-02352026) и Фонд Imagine Institute (Париж, Франция).

1. Трансдукция MLV клеток человека <ol><li> Изолируйте клетки-мишени и трансдуцируйте их с помощью ретровирусного вектора, содержащего MLV, несущего репортерный ген eGFP и псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита G (VSV-G) или гликопротеина с амфотропной оболочкой 16 ...

<ol>
	<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+enhancers:+from+properties+to+genome-wide+predictions.">Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions.</a> Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).</li><li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes.">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state.">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li><li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-enhancers+in+the+control+of+cell+identity+and+disease.">Super-enhancers in the control of cell identity and disease.</a> Cell. 155 (4), 934-947 (2013).</li><li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+identifies+active+regulatory+elements+in+human+multipotent+hematopoietic+progenitors.">High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors.</a> Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).</li><li>Biasco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+profile+of+retroviral+vector+in+gene+therapy+treated+patients+is+cell-specific+according+to+gene+expression+and+chromatin+conformation+of+target+cell.">Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell.</a> EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).</li><li>De Ravin, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancers+are+major+targets+for+murine+leukemia+virus+vector+integration.">Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration.</a> J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).</li><li>LaFave, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mLV+integration+site+selection+is+driven+by+strong+enhancers+and+active+promoters.">mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters.</a> Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).</li><li>Gupta, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromo-+and+extraterminal+domain+chromatin+regulators+serve+as+cofactors+for+murine+leukemia+virus+integration.">Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration.</a> J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BET+proteins+promote+efficient+murine+leukemia+virus+integration+at+transcription+start+sites.">BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).</li><li>De Rijck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BET+family+of+proteins+targets+moloney+murine+leukemia+virus+integration+near+transcription+start+sites.">The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites.</a> Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).</li><li>Romano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional,+epigenetic+and+retroviral+signatures+identify+regulatory+regions+involved+in+hematopoietic+lineage+commitment.">Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment.</a> Sci Rep. 6, 24724 (2016).</li><li>Cavazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Transcriptional+and+Epigenetic+Regulation+of+Human+Epidermal+Keratinocyte+Differentiation.">Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation.</a> Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).</li><li>Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+helper-free+amphotropic+retroviruses+that+transduce+a+dominant-acting,+methotrexate-resistant+dihydrofolate+reductase+gene.">Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene.</a> Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).</li><li>Cattoglio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+mapping+of+retroviral+integration+sites+defines+the+fate+of+allogeneic+T+cells+after+donor+lymphocyte+infusion.">High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion.</a> PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).</li><li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151 (2013).</li><li>Biffi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+benefits+metachromatic+leukodystrophy.">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy.</a> Science. 341 (6148), 1233158 (2013).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Gillet, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+genomic+environment+of+the+provirus+determines+the+abundance+of+HTLV-1-infected+T-cell+clones.">The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones.</a> Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).</li></ol>

Здесь мы описали протокол для геномного картирования сайтов интеграции mlV, ретровирус, который нацелен на участки хроматина, эпигенетически обозначенные как активные промоторы и энхансеры. Критические шаги и / или ограничения протокола включают в себя: (i) трансдукцию mlV популяции клет?...

Идентичность клетки определяется экспрессией определенных наборов генов. Роль цис-регуляторных элементов, таких как промоторы и энхансеры, имеет решающее значение для активации транскрипционных программ клеточного типа. Эти регуляторные области характеризуются специфическими хроматинными особенностями, такими как специфические модификации гистонов, факторы транскрипции и связывание кофакторов, а также доступность хроматина, которые широко используются для их идентификации по всему геному в нескольких типах клеток 1 , 2 , 3 . В частности, широкоформатный профиль ацетилирования гистона Н3-лизина 27 (H3K27ac) обычно используется для определения активных промоторов, энхансеров и суперусилителей 4 , 5 , 6 . Вирус мышиной лейкемии Молони (MLV) является гамма-ретровирусом, который широко используется для генаПеренос в клетках млекопитающих. После заражения клетки-мишени ретровирусный РНК-геном ретро-транскрибируется в двухцепочечной молекуле ДНК, которая связывает вирусные и клеточные белки, чтобы собрать преинтегрирующий комплекс (PIC). ПИК входит в ядро ​​и связывает хроматин клетки-хозяина. Здесь, вирусная интеграза, ключевой компонент ПОС, опосредует интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Интеграция mLV в геномной ДНК не является случайной, но происходит в активных цис-регуляторных элементах, таких как промоторы и энхансеры, клеточно-специфическим способом 7 , 8 , 9 , 10 . Этот специфический профиль интеграции опосредуется прямым взаимодействием между mLV интегразой и клеточными бромдоменными и внетерминальными доменами (BET) белками 11 , 12 , 13 . BET белки (BRD2, BRD3 иBRD4) действуют как мостик между хроматином хозяина и mLV PIC: через их bromodomains они распознают высокоацетилированные цис-регуляторные области, в то время как внетерминальный домен взаимодействует с mLV интегразой 11 , 12 , 13 . Здесь мы опишем ретровирусное сканирование, новый инструмент для отображения активных цис-регуляторных областей на основе интеграционных свойств mLV. Вкратце, клетки трансдуцированы с помощью полученного из MLV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). После экстракции геномной ДНК соединения между длинным 3&#39;-концевым повтором (LTR) вектора mLV и геномной ДНК амплифицируют с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR) и последовательно секвенируют. Сайты интеграции mLV отображаются на геном человека, а геномные области с высокой концентрацией митохондрий определяются как кластеры сайтов интеграции mLV. Ретровирусное сканированиеNing был использован для определения клеточных специфических активных регуляторных элементов в нескольких первичных клетках человека 14 , 15 . MlV кластеров, совместно отображаемых с эпигенетически определенными промоторами и энхансерами, большинство из которых содержат активные гистоновые метки, такие как H3K27ac, и являются клеточно-специфичными. Ретровирусное сканирование позволяет проводить идентификацию регуляторных элементов ДНК в проспективно очищенных клеточных популяциях 7 , 14 , а также в ретроспективно определенных клеточных популяциях, таких как стволовые клетки кератиноцитов, которые не обладают эффективными маркерами для предполагаемой изоляции 15 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 ml tubes</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51306</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker Plus Strand oligonucleotide</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3&#8217;&#160; (Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker Minus Strand oligonucleotide</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3&#8217; (Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru9I</td>
			<td>Roche-Sigma-Aldrich</td>
			<td>11464825001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRE/Cut Buffer M</td>
			<td>Roche-Sigma-Aldrich</td>
			<td>11417983001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PstI&#160;</td>
			<td>Roche-Sigma-Aldrich</td>
			<td>10798991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuRE/Cut Buffer H</td>
			<td>Roche-Sigma-Aldrich</td>
			<td>11417991001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP Mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18427013</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR grade water</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linker primer</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3&#8217; (Purification grade: PCR grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLV-3&#8217; LTR primer</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3&#8217; (Purification grade: PCR grade)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linker nested primer 454</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLV-3&#8217; LTR nested primer 454</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linker nested primer Illumina</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLV-3&#8217; LTR nested primer Illumina</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (absolute) for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K4500-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp DNA ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628019</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6X Loading Buffer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001 or FC-131-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&#160;</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnetic stand for 2 ml tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP 60 ml kit</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2200 TapeStation system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2964AA</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5583</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism)</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4329003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1.0 N, molecular biology-grade</td>
			<td>general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT1 (Hybridization Buffer)</td>
			<td>Illumina&#160;</td>
			<td>Provided in the MiSeq Reagent Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral scanning: mapping mlv integration sites to define cell-specific regulatory regions

Вирусные ретровирусные векторы вируса мышиной лейкемии Moloney (MLV) преимущественно интегрируются в ацетилированные энхансеры и промоторы. По этой причине сайты интеграции mlV могут использоваться как функциональные маркеры активных регуляторных элементов. Здесь мы представляем ретровирусный сканирующий инструмент, который позволяет идентифицировать клеточные энхансеры и промоторы по всему геному. Вкратце, популяция клеток-мишеней трансдуцирована вектором, полученным из mlV, и геномную ДНК расщепляют часто режущим ферментом рестрикции. После лигирования геномных фрагментов с совместимым ДНК-линкером, линкер-опосредованная полимеразная цепная реакция (LM-PCR) позволяет амплифицировать геномные соединения вирус-хозяин. Массивное секвенирование ампликонов используется для определения профиля интеграции mLV в геноме. Наконец, кластеры рекуррентной интеграции определены для идентификации специфичных к клеткам регуляторных областей, ответственных за активацию программ транскрипции, специфичных для клеточного типа. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Инструмент ретровирусного сканирования позволяет идентифицировать геномные промоторы и энхансеры, специфичные для клеток, в перспективно изолированных популяциях целевых клеток. Примечательно, что ретровирусное сканирование представляет собой инструментальный метод ретроспективной идентификации редких популяций ( например, соматических стволовых клеток), у которых отсутствуют надежные маркеры для предполагаемой изоляции.

Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования схематизирован на рисунке 1 . Заселенность клеток-мишеней очищают и трансдуцируют с помощью полученного из ...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions at JoVE.com

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Здесь мы опишем протокол для общего геномирования сайтов интеграции вирусных ретровирусных векторов мышиной лейкемии Moloney в клетках человека.

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping и CRISPR / Cas9 для определения гена резистентности к лекарственным средствам в<em&gt; Токсоплазма гондии</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Быстрый и количественный метод для столб-поступательные изменения и вариант включено сопоставление пептидов в геномов

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...