Name: a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00
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この研究は、自然科学およびエンジニアリング研究協議会（Canada Discovery Grant）RGPIN36481-08によってWilliam G. Bendenaに支持された。

1.実験生物の調製<ol><li> 生物が試験の際に若年成人であることを確認するために、アッセイを開始する24時間前に10株あたり10 L4段階の線虫を選ぶ。試験したそれぞれの突然変異体または対照線虫について、10匹のL4s（対照については10、アッセイについては10）を選択する。 <ol><li>標準的な方法26、OP50 大腸菌を播種し、標準的な寒天プレート上で...

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans+(October+25,+2006).">Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+modulation+disorders+in+childhood+epilepsy.">Sensory modulation disorders in childhood epilepsy.</a> J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).</li><li>Festa, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical+disconnectivity+disrupts+sensory+integration+in+Alzheimer's+disease.">Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease.</a> Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).</li><li>Boecker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+processing+in+Parkinson's+and+Huntington's+disease:+investigations+with+3D+H(2)(15)O-PET.">Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET.</a> Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).</li><li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+disease+in+Caenorhabditis+elegans.">Modeling human disease in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+in+high-throughput+drug+discovery.">C. elegans in high-throughput drug discovery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).</li><li>Thompson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+million+mutation+project:+a+new+approach+to+genetics+in+Caenorhabditis+elegans.">The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).</li><li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit.">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li><li>Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+signaling+in+C.+elegans+mediated+by+the+GLR-1+glutamate+receptor.">Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor.</a> Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).</li><li>Chalasani, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+pathways+mediate+touch+and+osmosensory+responses+in+a+polymodal+sensory+neuron.">Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron.</a> J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).</li><li>Ishihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEN-1,+a+secretory+protein+with+an+LDL+receptor+motif,+regulates+sensory+integration+and+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 109 (5), 639-649 (2002).</li><li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).</li><li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+status+and+serotonin+rapidly+and+reversibly+modulate+a+Caenorhabditis+elegans+chemosensory+circuit.">Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).</li><li>Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPR-9,+a+Galanin-Like+G-Protein+Coupled+Receptor,+and+GLR-1+Regulate+Interneuronal+Circuitry+Underlying+Multisensory+Integration+of+Environmental+Cues+in+Caenorhabdities+elegans.">NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans.</a> PLoS Genet. 12 (5), (2016).</li><li>Harris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans.">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li><li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol:+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genet. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+(July+3,+2006).">Behavior (July 3, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Sambongi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+cadmium+and+copper+ions+by+externally+exposed+ADL,+ASE,+ASH+neurons+elicits+avoidance+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans.</a> NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).</li><li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans.">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).</li><li>Rechavi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation-Induced+Transgenerational+Inheritance+of+Small+RNAs+in+C.+elegans.">Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans.</a> Cell. 158 (2), 277-287 (2014).</li><li>Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans.">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PLoS One. 8 (7), (2013).</li></ol>

このアッセイ設計は、食品レースアッセイ24を変更して、嫌気性正中線バリアを作成し、線虫の損失を防ぐためにプレートの縁の周りに銅溶液を含むようにする。生物は、嫌悪の障壁を横切り、4時間にわたって食物パッチに達する能力について試験される。 npr-9（GF）との関連で 、我々は飢餓状態が嫌悪反応および食物の検出にどのように影響するかを評価するため?...

Caenorhabditis elegansは、わずか302個のニューロンのみからなる神経系の回路分析の比較的容易さのために、数十年間の神経生物学の研究のモデルとして用いられてきた1 。有機体が環境の合図に反応することに頼っているならば、神経系の多くは環境信号の統合を規制することに専念している2 。その神経系の単純さにもかかわらず、 C.エレガンスは、忌避剤3 、誘引物質4 、温度5 、さらには湿度6を含む多様な環境シグナルを検出し、応答することができる。適切に環境シグナルを統合するための失敗は、哺乳動物モデル系の7- 9における行動障害および神経変性条件の数にリンクされています。様々な利用可能な神経疾患モデル<html> C. elegansの 10 株および線虫医薬スクリーン11の開発により、この生物は神経生物学の研究に有用なシステムであることが証明されています。ほぼすべての線虫ゲノム12中の遺伝子、線虫の神経系の我々の理解、ひいては私たち自身にマッピングされた線虫のコネクトーム1および変異の利用可能性を考えると、部分的に創造適切なアッセイの設計によって制限されています。 走化性アッセイの数は、多様な嫌悪刺激3、4、13、14、15に線虫応答性を評価するために、過去40年にわたって開発されてきました。最初の実験では、急速な環境刺激の導入が関与していたが、単一のワームが寒天プレート= &quot;XREF&quot;&gt; 3、14、16。歩行応答に対する即時の変化が記録された。例えば、揮発性臭気物質オクタノールは、毛髪に適用され、野生型ワーム17における後方移動の開始を刺激するために、線虫の鼻の前で漂流され得る。行動選択の評価手段として複数の変数を組み込むために、より複雑なアッセイも開発されている18 。このアッセイのバリエーションには、銅溶液を使用して嫌気性中線バリアを作成することが必要です4 。誘引物質、すなわちジアセチルは、ジアセチル源から離れて移動した虫の化学的障壁の一方の側に置かれた。銅の嫌悪反応に欠陥のあるワームは直ちに障壁を越えてジアセチルに達し、野生型ワームは最初に障壁によって反発した。ワームが最初に銅の障壁に近づいたときの応答が採点された長期間の観察なしに。 ワームが飢餓状態を経て評価されると、環境刺激に対する感受性は低下する19 。忌み嫌う化学オクタノールが線虫の鼻の前で漂流されると、野生型生物は食べ物の上に3〜5秒以内に後退運動を刺激する。これらの生物は10分間食品から除去された後、8〜10秒の遅れた応答を示す20 。したがって、飢餓が増加すると、食物の探索が生存にとってより重要になるので、線虫は有害な環境シグナルに対する嫌悪反応を減少させる。逆に、その過剰発現神経ペプチド受容体9（NPR-9）線虫、食品オンまたはオフオクタノールに応答し、嫌悪刺激21の数に対応することができないことを示しません。これらのnpr-9（GF）生物はまた、食物の存在下でそれらの逆転頻度を調節しないが、過酷なタッチ刺激に反応して逆方向に動き、後方への移動21が可能であることを示す。我々はまた、彼らはまだ食べ物オフ異常な低下反転周波数を示すことが与えられたNPR-9（LF）の変異体は、食品21の存在下で、彼らの行動を調節することができる評価しました。急性外部刺激の導入により、ワームの栄養状態を結合することは食品関連の経路が広く感覚シグナル伝達が22、23の経路を調節することができますするメカニズムの解明に支援しています。線虫環境における食物の存在はまた、エタノール離脱反応を評価するために使用されている24 。この実験では、ワームを様々な濃度のエタノール中でインキュベートし、次いで「飼料競合アッセイ」として知られている寒天プレート上に置いた。食物パッチをプレートの一端に置き、線虫をw食品源から離れて置かれている。エタノール離脱は、ワームが食物のパッチに到達するのに必要な時間を測定することによって評価した。 この栄養ベースの銅回避アッセイは、時間経過に伴う行動変化を評価しながら、追加の環境変数、すなわち食物および銅を統合するための食品競争アッセイに基づいている。これはC. elegansコミュニティー全体で一般的に使用されるプロトコルの適応です4 。このプロトコールは、嫌悪反応および4時間にわたる食物の検出を評価するために使用されている21 。ワームの展示飢餓行動ので、絶食25の30分後、我々はまた、栄養状態への変更は、環境対応に影響を与えることができるかを評価することができます。このアッセイの条件は、実験生物が時間の経過とともに嫌悪感の刺激に反応する反応をどのように変化させるかを測定するため、行動変化を生物は飢えた状態に向かって進行する（そして継続的な飢餓の継続的な測定）。 npr-9（GF）動物は、食べ物や多くの嫌悪的な手がかりに反応して行動を変えないので、これらの行動障害が飢餓の状況で持続するかどうかを特定しようとした。最終的に、このアッセイ設計は、 npr-9（GF）突然変異体を特異的に評価するように処方されているが、新規な菌株を特徴付けるためにさらに適合させることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

生き残りを確実にするために、生物は、不安定な生息地を避け、一貫した食物源を確保することができなければならない。 Caenorhabditis elegansは、多様な環境刺激の検出時に彼らの歩行パターンを変更し、飢餓状態に応じて行動反応のスイートを調整することができます。線虫は、典型的には、食物源から30分を超えて除去されると、嫌悪反応が減少する。変化する栄養状態に応答する行動変化の観察は、十分に栄養を与えられた状態から飢餓状態への移行を調節する機構に洞察を与えることができる。 本発明者らは、嫌悪な障壁（ すなわち、銅）を横切って長時間にわたり食物源に到達する線虫の能力を測定するアッセイを開発した。このプロトコルは、以前の研究を基にしています。有機体がますます飢えている状態。さらに、このアッセイは、より大きい線虫の集団を同時に評価することができるように、増加したサンプルサイズを可能にする。 銅を検出または応答する能力に欠陥がある生物は、化学バリアを直ちに横切り、一方、野生型線虫は最初に忌避される。野生型ワームはますます飢えているので、障壁を越えて食物源に到達し始めます。我々は、食品感覚または嫌悪な化学物質の検出を含む、多様な環境的合図に応答することができない変異体を評価するためにこのアッセイを設計した。このプロトコルで評価したところ、欠陥のある生物はすぐに障壁を越えたが、食物源を検出することもできなかった。したがって、これらの突然変異体は一時的に食物源に達するにもかかわらず、化学的バリアを繰り返し交差する。このアッセイは、嫌悪と飢餓に関連する可能性のある経路の欠陥を評価するために、ワームの集団を直接的に試験することができる。

野生型（N2）、 npr-9（tm1652）およびnpr-9過剰発現株、 すなわち npr-9（GF） （IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp）、飢餓と銅嫌悪に対する応答を評価する。野生型生物は、 嫌気的銅障壁を検出し応答することができるが、 npr-9（GF）突然変異体は、4時間のアッセイ21で銅に対して嫌悪反応を開始しない...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;栄養状態ベースの銅回避アッセイ

ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

The overall goal of this nutritional-status based copper aversion assay is to evaluate nematode responsive to an aversive chemical and a food source over a four hour period. This allows for the simultaneous evaluation of nutritional-status. This method can aid the field of behavioral neuroscience by identifying mutants that fail to modulate locomotory patterns and response to an aversive chemical despite starvation conditions.The main advantage of this technique is that it can be conducted over an extended time period, which allows for nutritional status analysis as worms become progressively more starved over four hours. To prepare experimental organisms for the assay, pick 10 L4 stage nematodes per stream, 24 hours prior to commencing the assay, to ensure that organisms are young adults when tested. For each mutant or control nematode tested, pick 10 L4s.Maintain L4 organisms, using standard methods for 24 hours on standard agar plates seeded with OP50 E.Coli. 24 hours prior to the assay, use a ruler and a thick permanent marker to draw a line on the underside of a previously prepared nematode growth media or NGM plate along the outer edge. Mark a midline barrier equidistant from each edge of the plate.Seed the plate with 50 microliters of OP50 E.Coli on only one side of the copper barrier to create a uniform lawn. Use the marked lines on the underside of the plate to ensure the bacteria will not contact the copper solution. Make sure the copper solution will line the edge of the plate and form a midline barrier and transfer the bacteria so that the copper solution will not contact the food source.Mark a second set of plates without OP50 E.Coli, to serve as the negative control. Allow the bacteria to dry, then incubate the plates at 37 degrees celsius overnight. Ensure that the bacteria patches are not disturbed when transferring the nematodes to a 37 degrees celsius incubator.Excessive disturbance could alter the location or shape of the food patch. After overnight incubation, remove plates from the incubator and using the marked underside of the plate as a guide, pipette 100 microliters of freshly prepared 0.5 molar copper(II)sulfate solution on the edge of the agar, to create an outer copper barrier. Pipette 25 microliters of the copper(II)sulfate solution to create a midline barrier.Ensure that the copper(II)sulfate solution does not contact the bacteria patch and allow copper solution to dry onto the plate. Check for dryness every five minutes after transfer, with a laboratory tissue by lightly dabbing the solution near the edge of the plate to discern. Immediately prior to the assay, transfer the experimental organisms to a bacteria free agar plate and allow the nematodes to move freely for one minute to remove excess bacteria.Next, pipette one milliliter of M9 onto the plate with young adults, that were transferred 24 hours previously in order to wash worms into a microcentrifuge tube. Centrifuge the nematodes at 3, 000 x G for one minute. Worms should form a pellet at the bottom of the tube.Aspirate M9 solution without disrupting the worm pellet. Add one milliliter of M9 solution to the worm pellet. Invert tube to mix worms with the solution.If excess bacteria were initially transferred with the worms, repeat for a total of five times. After the final wash, aspirate the supernatant until 100 microliters of M9 solution and the worm pellet remains. Immediately transfer worms from solution once the washed ups have been completed.Pipette 20 microliters of the worm pellet from the bottom of the tube onto the bacteria free half of the assay plate, ensure that 10 worms are transferred to the assay plate and that no contaminating food is present. No bacteria should be transferred to the copper food race plates. Remove excess M9 solution from the nematodes with a laboratory tissue within one minute.Ensure the M9 solution does not contact the copper(II)sulfate solution and that the worms and agar surface remain intact. Discard worms that have accidentally been removed with the laboratory tissue. Once the M9 solution has been removed, and all worms have commenced non-liquid locomotor patterns, I.e when they have stopped thrashing.Start the assay stopwatch, if extra worms were accidentally included, remove them by picking with halocarbon oil to ensure that no bacteria are added to the plate. Check assay plates every 30 minutes. For the assay plates with bacteria patches, positively score organisms if they reach the food patch over a four hour period.For the negative control plates, positively score organisms if they have crossed the barrier. We utilized the N2 and npr-9 loss of function mutant and an npr-9 overexpression strain, referred to as npr-9 gain a function, to evaluate responses to starvation and copper aversion. By the end of the assay, 100%of wild type organisms relocated to the food source, while the npr-9 over expression organisms did not modulate locomotory patterns in response to food and continued to cross the aversive barrier even after contacting the food source.On a food free plate, n2 or npr9 loss of function organisms rarely crossed the copper barrier while the npr-9 overexpression nematodes repeatedly cross the barrier back and forth. While attempting this procedure, it's important to remember to avoid disrupting the copper barrier when transferring nematodes and M9 and to also maintain consistent conditions for each strain to avoid confounding factors.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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