Name: a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 para William G. Bendena.

1. Preparação de organismos experimentais <ol><li> Escolha 10 nemátopos encenados L4 por estirpe 24 h antes de iniciar o ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nematóide de controle testado, escolha 10 L4s (10 para o controle e 10 para o ensaio). <ol><li> Manter os organismos L4 usando métodos padrão 26 , 27 durante 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichi...

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans+(October+25,+2006).">Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+pathways+mediate+touch+and+osmosensory+responses+in+a+polymodal+sensory+neuron.">Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron.</a> J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans.">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li><li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol:+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans.">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PLoS One. 8 (7), (2013).</li></ol>

Este design de ensaio modifica o ensaio de ração alimentar 24 para incluir uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva e ao redor da borda da placa para evitar a perda de nemátodos. Os organismos são testados quanto à sua capacidade de atravessar a barreira aversiva e alcançar um parto alimentar ao longo de um período de 4 h. No contexto de npr-9 (GF) , utilizamos este ensaio para avaliar como as condições de inanição podem a...

Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios 1 . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais 2 . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes 3 , atrativos 4 , temperatura 5 e até mesmo umidade 6 . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos 7- 9. Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural<html> 10 em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos 11 , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado 1 e mutações para quase todos os genes do genoma 12 do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados. Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens 17 . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis ​​múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental 18 . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva 4 . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo. Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui 19 . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s 20 . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos 21 . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás 21 . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos 21 . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial 22 , 23 . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol 24 . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como &quot;ensaio de raça alimentar&quot;. O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos. Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ​​ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans 4 . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas 21 . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos 25 , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Para garantir a sobrevivência, os organismos devem ser capazes de evitar habitats desfavoráveis, garantindo uma fonte consistente de alimentos. Caenorhabditis elegans alteram seus padrões de locomotriz após a detecção de diversos estímulos ambientais e podem modular seu conjunto de respostas comportamentais em resposta a condições de fome. Os nemematódios exibem tipicamente uma resposta aversiva diminuída quando removidos de uma fonte de alimento durante mais de 30 min. A observação de mudanças comportamentais em resposta a um estado nutricional em mudança pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a transição de um estado bem alimentado para um estado de fome. Nós desenvolvemos um ensaio que mede a capacidade de um nematóide de atravessar uma barreira aversiva ( isto é, cobre) e chegar a uma fonte de alimento durante um período prolongado de tempo. Este protocolo baseia-se no trabalho anterior, integrando múltiplas variáveis ​​de forma a permitir a coleta contínua de dados à medida que os organismos se deslocam para umaN condição cada vez mais fome. Além disso, este ensaio permite um aumento do tamanho da amostra para que populações maiores de nemátodos possam ser avaliadas simultaneamente. Os organismos defeituosos para a capacidade de detectar ou responder ao cobre imediatamente atravessam a barreira química, enquanto os nemátodos de tipo selvagem são inicialmente repelidos. À medida que os vermes de tipo selvagem estão cada vez mais famintos, eles começam a atravessar a barreira e chegar à fonte de alimento. Nós projetamos este ensaio para avaliar um mutante incapaz de responder a diferentes pistas ambientais, incluindo a sensação de alimentos ou a detecção de produtos químicos aversivos. Quando avaliados através deste protocolo, os organismos defeituosos atravessaram imediatamente a barreira, mas também foram incapazes de detectar uma fonte de alimento. Portanto, esses mutantes atravessam repetidamente a barreira química apesar de terem chegado temporariamente a uma fonte de alimento. Este ensaio pode facilmente testar populações de vermes para avaliar potenciais defeitos de via relacionados à aversão e à fome.

Utilizamos o tipo selvagem (N2), npr-9 (tm1652) e uma tensão de supressão npr-9 , ou seja , npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para avaliar as respostas à fome e à aversão ao cobre. Os organismos de tipo selvagem são capazes de detectar e responder à barreira de cobre aversiva, enquanto os mutantes npr-9 (GF) não iniciam uma resposta aversiva ao cobre ao longo do ensaio <sup class="xref"...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

The overall goal of this nutritional-status based copper aversion assay is to evaluate nematode responsive to an aversive chemical and a food source over a four hour period. This allows for the simultaneous evaluation of nutritional-status. This method can aid the field of behavioral neuroscience by identifying mutants that fail to modulate locomotory patterns and response to an aversive chemical despite starvation conditions.The main advantage of this technique is that it can be conducted over an extended time period, which allows for nutritional status analysis as worms become progressively more starved over four hours. To prepare experimental organisms for the assay, pick 10 L4 stage nematodes per stream, 24 hours prior to commencing the assay, to ensure that organisms are young adults when tested. For each mutant or control nematode tested, pick 10 L4s.Maintain L4 organisms, using standard methods for 24 hours on standard agar plates seeded with OP50 E.Coli. 24 hours prior to the assay, use a ruler and a thick permanent marker to draw a line on the underside of a previously prepared nematode growth media or NGM plate along the outer edge. Mark a midline barrier equidistant from each edge of the plate.Seed the plate with 50 microliters of OP50 E.Coli on only one side of the copper barrier to create a uniform lawn. Use the marked lines on the underside of the plate to ensure the bacteria will not contact the copper solution. Make sure the copper solution will line the edge of the plate and form a midline barrier and transfer the bacteria so that the copper solution will not contact the food source.Mark a second set of plates without OP50 E.Coli, to serve as the negative control. Allow the bacteria to dry, then incubate the plates at 37 degrees celsius overnight. Ensure that the bacteria patches are not disturbed when transferring the nematodes to a 37 degrees celsius incubator.Excessive disturbance could alter the location or shape of the food patch. After overnight incubation, remove plates from the incubator and using the marked underside of the plate as a guide, pipette 100 microliters of freshly prepared 0.5 molar copper(II)sulfate solution on the edge of the agar, to create an outer copper barrier. Pipette 25 microliters of the copper(II)sulfate solution to create a midline barrier.Ensure that the copper(II)sulfate solution does not contact the bacteria patch and allow copper solution to dry onto the plate. Check for dryness every five minutes after transfer, with a laboratory tissue by lightly dabbing the solution near the edge of the plate to discern. Immediately prior to the assay, transfer the experimental organisms to a bacteria free agar plate and allow the nematodes to move freely for one minute to remove excess bacteria.Next, pipette one milliliter of M9 onto the plate with young adults, that were transferred 24 hours previously in order to wash worms into a microcentrifuge tube. Centrifuge the nematodes at 3, 000 x G for one minute. Worms should form a pellet at the bottom of the tube.Aspirate M9 solution without disrupting the worm pellet. Add one milliliter of M9 solution to the worm pellet. Invert tube to mix worms with the solution.If excess bacteria were initially transferred with the worms, repeat for a total of five times. After the final wash, aspirate the supernatant until 100 microliters of M9 solution and the worm pellet remains. Immediately transfer worms from solution once the washed ups have been completed.Pipette 20 microliters of the worm pellet from the bottom of the tube onto the bacteria free half of the assay plate, ensure that 10 worms are transferred to the assay plate and that no contaminating food is present. No bacteria should be transferred to the copper food race plates. Remove excess M9 solution from the nematodes with a laboratory tissue within one minute.Ensure the M9 solution does not contact the copper(II)sulfate solution and that the worms and agar surface remain intact. Discard worms that have accidentally been removed with the laboratory tissue. Once the M9 solution has been removed, and all worms have commenced non-liquid locomotor patterns, I.e when they have stopped thrashing.Start the assay stopwatch, if extra worms were accidentally included, remove them by picking with halocarbon oil to ensure that no bacteria are added to the plate. Check assay plates every 30 minutes. For the assay plates with bacteria patches, positively score organisms if they reach the food patch over a four hour period.For the negative control plates, positively score organisms if they have crossed the barrier. We utilized the N2 and npr-9 loss of function mutant and an npr-9 overexpression strain, referred to as npr-9 gain a function, to evaluate responses to starvation and copper aversion. By the end of the assay, 100%of wild type organisms relocated to the food source, while the npr-9 over expression organisms did not modulate locomotory patterns in response to food and continued to cross the aversive barrier even after contacting the food source.On a food free plate, n2 or npr9 loss of function organisms rarely crossed the copper barrier while the npr-9 overexpression nematodes repeatedly cross the barrier back and forth. While attempting this procedure, it's important to remember to avoid disrupting the copper barrier when transferring nematodes and M9 and to also maintain consistent conditions for each strain to avoid confounding factors.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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