Name: establishing dual resistance to egfr-tki and met-tki in lung adenocarcinoma cells in vitro with a 2-step dose-escalation procedure
Uploaded: 2017-08-11T14:00:00
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Agradecemos a los miembros del Instituto de Oncología Molecular por sus reflexivos comentarios y consejos y Editage por su ayuda con la edición de lengua inglesa. Este trabajo fue apoyado por el programa respaldado por el MEXT para la Fundación de investigación estratégica en universidades privadas (2012-2016) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón. Tohru Ohmori recibió financiación (2015-2016) de la investigación de Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Alemania).

1. establecer las células resistentes a Gefitinib
<ol>
	<li>Determinar la concentración inicial de gefitinib por análisis de bromuro (MTT) diphenyltetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-.
	<ol>
		<li>PC-9 células en medio del crecimiento de la cultura (el Medio RPMI-1640 con 10% FBS y 1% antibióticos (penicilina: 100 U/mL y estreptomicina: 100 μg/mL)), en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
		<li>Ajustar las células a 1,0 × 105 células/mL usando una célula automa...

<ol>
	<li>Lynch, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+the+epidermal+growth+factor+receptor+underlying+responsiveness+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).</li><li>Paez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutations+in+lung+cancer:+correlation+with+clinical+response+to+gefitinib+therapy.">EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy.</a> Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).</li><li>Pao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+receptor+gene+mutations+are+common+in+lung+cancers+from+"never+smokers"+and+are+associated+with+sensitivity+of+tumors+to+gefitinib+and+erlotinib.">EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).</li><li>Mitsudomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+predict+prolonged+survival+after+gefitinib+treatment+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+with+postoperative+recurrence.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence.</a> J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Engelman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+amplification+leads+to+gefitinib+resistance+in+lung+cancer+by+activating+ERBB3+signaling.">MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling.</a> Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).</li><li>Schmidt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutations+of+the+MET+proto-oncogene+in+papillary+renal+carcinomas.">Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas.</a> Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).</li><li>Olivero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+the+ATP-binding+site+of+the+MET+oncogene+tyrosine+kinase+in+a+HPRCC+family.">Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family.</a> Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).</li><li>Janne, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AZD9291+in+EGFR+inhibitor-resistant+non-small-cell+lung+cancer.">AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer.</a> N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).</li><li>Bean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+amplification+occurs+with+or+without+T790M+mutations+in+EGFR+mutant+lung+tumors+with+acquired+resistance+to+gefitinib+or+erlotinib.">MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).</li><li>. NCT02468661 - ClinicalTrials.gov Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661</a> (2017)</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+Resistance+Mechanisms+to+Combination+Met-TKI/EGFR-TKI+Exposure+in+Met-Amplified+EGFR-TKI-Resistant+Lung+Adenocarcinoma+Harboring+an+Activating+EGFR+Mutation.">Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation.</a> Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Cifone, M. A., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+patterns+of+anchorage-independent+growth+with+in+vivo+behavior+of+cells+from+a+murine+fibrosarcoma.">Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).</li><li>Ercan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+T790M+causes+resistance+to+an+irreversible+EGFR+inhibitor.">Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor.</a> Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).</li><li>Ogino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+epidermal+growth+factor+receptor+T790M+mutation+during+chronic+exposure+to+gefitinib+in+a+non+small+cell+lung+cancer+cell+line.">Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line.</a> Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+sensitivity+to+tumor+necrosis+factor+alpha+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+with+acquired+resistance+to+gefitinib.">Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).</li><li>Suda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+complementary+role+of+MET+amplification+and+EGFR+T790M+mutation+in+acquired+resistance+to+kinase+inhibitors+in+lung+cancer.">Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer.</a> Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).</li><li>Shien, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+is+associated+with+a+manifestation+of+stem+cell-like+properties+in+cancer+cells.">Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells.</a> Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).</li><li>Sagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+three+cisplatin-resistant+endometrial+cancer+cell+lines+using+two+methods+of+cisplatin+exposure.">Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure.</a> Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).</li><li>Ritter, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+breast+cancer+cells+selected+for+resistance+to+trastuzumab+in+vivo+overexpress+epidermal+growth+factor+receptor+and+ErbB+ligands+and+remain+dependent+on+the+ErbB+receptor+network.">Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network.</a> Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).</li></ol>

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para el establecimiento de dual-resistencia adquirida de las células cancerosas mediante un método de escalamiento de dosis de 2-step in vitro. Muchos trabajos de investigación han informado de que las células PC-9 desarrollaron EGFR-TKI (gefitinib o erlotinib) resistencia a través de las mutaciones de EGFR T790M15,16. Sin embargo, no detectamos T790M mutaciones en el exón 20 de nuestras células PC-9MET...

Las mutaciones oncogénicas en el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se encuentran en un subgrupo de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y son importantes biomarcadores predictivos de la enfermedad1,2. Estas activando mutaciones de EGFR comúnmente ocurren como una canceladura en-marco en el exón 19 (delE746-A750) o una mutación de punto sustitución de leucina con arginina en el codón 858 del exón 21 (L858R) en el EGFR tirosina quinasa dominio3,4. El tratamiento con inhibidores de EGFR tirosina cinasa (ITC) es una terapia clínicamente efectiva para pacientes con CPCNP que mutaciones de EGFR. Sin embargo, esta terapia está limitada por la inevitable adquisición de resistencia a los EGFR-ITC como gefitinib y erlotinib. La resistencia adquirida más común se produce por una mutación T790M secundaria en el exón 20 del EGFR, que fue detectado en aproximadamente el 60% de los pacientes que adquirieron (EGFR-TKI gefitinib o erlotinib) resistencia. Otros mecanismos moleculares asociados con resistencia adquirida a EGFR-ITC son activación de bypass señalización causada por la amplificación de MET, transformación de los cánceres de pulmón de células pequeñas y la transición epitelial-a-mesenquimales5,6. El receptor para el factor de crecimiento, codificado por el gen MET, que dysregulatedin muchos tumores, se ha divulgado para ser un candidato importante para el objetivo terapias7,8.
Estrategias para la superación de la resistencia adquirida a los EGFR-ITC ahora son sometidos a evaluación clínica. Estudios preclínicos y clínicos han demostrado que los inhibidores de EGFR de tercera generación como osimertinib son eficaces para los pacientes con la mutación T790M del9. Además, el crecimiento de los cánceres de EGFR mutante con amplificación de la MET puede ser inhibido por el tratamiento combinado con EGFR y MET ITC6,10. Ensayos clínicos que evalúan una combinación de inhibidores de MET y EGFR en pacientes con resistencia adquirida a gefitinib y erlotinib en marcha ahora son11.
Para estudiar el mecanismo molecular de resistencia adquirida a los agentes quimioterapéuticos, líneas de células que inicialmente responden a los inhibidores son tratadas continuamente con estos inhibidores. Existen dos métodos para establecer resistencia adquirida en líneas celulares. Se paso de escalada de dosis, y la otra es la alta concentración exposición. El método de escalada paso a paso se ha utilizado más comúnmente, ya que tiene una mayor tasa de éxito. Primero se exponen las células a bajas concentraciones de los inhibidores, casi una décima parte del valor de concentración inhibitoria media máxima (IC50), y la concentración luego gradualmente aumenta en un 10-30% hasta alcanza la concentración objetivo. El método de exposición de alta concentración implica exponer las células a la dosis final de inhibidor en el medio de cultivo, que es más que el valor de IC50 , así que matan a las células parentales casi totalmente. Este método de exposición de alta concentración tiene mucho una tasa de éxito menor que el método de escalada paso a paso.
En un estudio anterior, el tratamiento combinado con EGFR-TKI y MET-TKI fue demostrado para ser eficaz en un sistema in vitro . Resistencia adquirida a un TKI de EFGR, gefitinib, fue establecida a través de la escalada gradual de 12 meses, junto con el MET-amplificación, y por lo tanto, una línea de células resistentes a gefitinib llamada PC-9MET1000 fue generado12.
El protocolo presentado aquí es un procedimiento de dosis escalada de dos etapas para la obtención de EGFR mutado NSCLC PC-9 células con resistencia dual a lo TKI de EGFR, gefitinib y MET-TKI, PHA665752 (figura 1). Este método para el establecimiento adquirió resistente en líneas celulares es relativamente fácil de realizar, con una alta tasa de éxito. El protocolo descrito puede ser modificado para el uso con inhibidores de otras drogas diana molecular y agentes citotóxicos así.

<table width="970">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:177px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">189-02025</td>
			<td style="width:309px;">with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:177px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G4100</td>
			<td>Non-Radioactive Cell Proliferation Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:177px;">gibco</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:177px;">gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">gefitinib</td>
			<td style="width:177px;">Selleck</td>
			<td style="width:119px;">S1025</td>
			<td>stocked 10 mM/EMSO at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">PHA665752</td>
			<td style="width:177px;">Selleck</td>
			<td style="width:119px;">S1070</td>
			<td>stocked 10 mM/EMSO at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">96-well plate</td>
			<td style="width:177px;">IWAKI</td>
			<td style="width:119px;">860-096</td>
			<td>flat bottom with lid, low evaporation type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">TC10 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:177px;">BIO RAD</td>
			<td>#1450010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="width:365px;height:26px;">CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay</td>
			<td style="width:177px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G4100</td>
			<td style="width:309px;">Dye Solution and Solubilization/Stop Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="width:365px;height:26px;">GraphPad Prism v.5.0 software</td>
			<td style="width:177px;">GraphPad Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="width:365px;height:26px;">PC-9</td>
			<td style="width:177px;">Riken BioResource Center</td>
			<td style="width:119px;">RCB4455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">P100 dish</td>
			<td style="width:177px;">FALCON</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing dual resistance to egfr-tki and met-tki in lung adenocarcinoma cells in vitro with a 2-step dose-escalation procedure

Resistencia a los medicamentos es un desafío importante en terapia del cáncer. La generación de sublíneas resistente en vitro es necesaria para descubrir nuevos mecanismos para superar este desafío. Aquí, un método de escalamiento de dosis de 2 pasos para el establecimiento de resistencia doble a un receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)-inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), gefitinib y una MET-TKI, PHA665752, se describe. Este método se basa en simples paso a paso escalada de dosis de los inhibidores para inducir adquirido resistencia en líneas celulares. El método alternativo para la generación de sublíneas resistente implica exponer las células a las altas concentraciones del inhibidor de la en un solo paso. El método de escalamiento de dosis escalonada tiene una mayor posibilidad de inducir con éxito adquirido resistencia a este método. Activación de EGFR mutaciones son biomarcadores de respuesta al tratamiento con EGFR-TKI, que es un tratamiento de primera línea aplicado para cánceres de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) que albergan estas mutaciones. Sin embargo, a pesar de informes de respuestas eficaces, el uso de EGFR-TKI es limitado porque los tumores inevitablemente adquieren resistencia. Los principales mecanismos detrás de resistencia EGFR-TKI incluyen una mutación secundaria en el sitio de gatekeeper, T790M en el exón 20 del EGFR y una señal de derivación de MET. Por lo tanto, una posible solución para este problema sería una combinación de EGFR-TKI y MET-TKI. Este tratamiento combinado ha demostrado ser eficaz en un modelo de estudio en vitro . Resistencia adquirida de gefitinib se estableció mediante MET-amplificación gradual escalada de dosis de gefitinib durante 12 meses, y se generó una línea de celular llamada PC-9MET1000 en un estudio anterior. Para investigar los mecanismos adquirido MET-TKI y EGFR-TKI resistencia, una MET-TKI, PHA665752, fue administrada a estas células con progresivo escalamiento de dosis en presencia de gefitinib para 12 meses. Este protocolo también se ha aplicado con éxito para un número de terapias de combinación para establecer resistencia adquirida a otras moléculas de inhibidor.

El resumen del protocolo presentado en este manuscrito se muestra en la figura 1, incluyendo la inducción de doble-resistencia adquirida a gefitinib y PHA665752 en las células PC-9 por un procedimiento de escalamiento de dosis de 2-step. La figura 2 muestra una disminución en la proliferación de células PC-9 parentales como la concentración de los aumentos de gefitinib. Esto indica que las células PC-9 se convirtieron en s...

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Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Se describe un método en vitro para establecer resistencia dual a un TKI de EGFR y un TKI de MET en las células cancerosas. Este método es útil para el desarrollo de tratamientos para los pacientes con mutaciones de EGFR, que presentan progresión de la enfermedad a pesar de tratamiento con MET-amplificación de EGFR-TKI. También puede ser modificado para inhibidores dirigidos a otras moléculas.

Establecer la doble resistencia y TKI de EGFR TKI se reunió en pulmón Adenocarcinoma células In Vitro con un procedimiento de escalamiento de dosis de 2-step

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

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JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

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A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

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