Name: nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis
Uploaded: 2017-12-14T13:00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Detta projekt var stöd i del av Johns Hopkins University, Office av profossen genom den Gateway Science Initiative.

Obs: Gjorts DNA renas från jorden (Baltimore County, Maryland) med en kommersiellt tillgänglig mark genomisk isolering kit (se Tabell för material). Använda en UV-spektrofotometer (se Tabell för material), renat genomisk DNA bör ha en 260/280 (nm) förhållandet &#62; 1,8 och en 260/230 förhållandet mellan 2.0-2.2 att säkerställa att provet är fritt från föroreningar. Mängden genomisk DNA som krävs för NS varierar från 200 ng 2 µg.
1. Snabb bibliotek förberedelse metod (kort protokoll)
Obs: Detta är ett kort protokoll. Se Tabell för material för snabb sekvensering kit.
<ol>
	<li>I en 0,2 mL tunna röret (se Tabell för material) lägga till 200 ng med hög molekylvikt DNA i en final av volym av 7,5 µL destillerat vatten.</li>
	<li>Tillsätt 2,5 µL av fragmentering mix (FM) från snabba bibliotek förberedelser kit och blanda försiktigt genom inversion. Pulse centrifug att snurra ner (1000 x g för 5 s).</li>
	<li>Placera provet i en termocykler (se Tabell för material) för en runda vid 30 ° C i 1 min följt av 75 ° C i 1 min. ta bort röret och puls centrifugen att snurra ner provet.</li>
	<li>Lägg 1 µL av snabb adapter och 0.2 µL av blunt/TA ligase master mix och sedan lagra det anpassade och uppbundna biblioteket på is. Obs: Om med hjälp av korta protokollet går vidare till steg 8</li>
</ol>
2. ligering sekvensering protokollet (lång protokoll): Gjorts DNA-fragmentering
Obs: Se Tabell av material för ligering sekvensering kit.
<ol>
	<li>Späd 1 µg av renat genomiskt DNA till en slutlig volym av 46 µL avjoniserat vatten.</li>
	<li>Överför provet till en DNA-fragmentering röret (se Tabell av material) och Centrifugera i 1 minut vid rumstemperatur vid 8000 x g använder en mikrocentrifug (se Tabell för material) för att producera ~ 8 kb genomisk fragment. Kontrollera att all vätska har gått in i samling röret.</li>
	<li>Invertera fragmentering röret, återvändande till centrifug och Centrifugera i 1 min att samla den fragmenterade genomiskt DNA in i nedre kammaren.</li>
	<li>Överföra den fragmenterade genomiskt DNA till en steril låg-DNA bindande 1,5 mL tub och analysera en del på en låg andel agarosgel (0,6%) att bekräfta fragmentering till &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. fragmenterad genomiskt DNA slutet-förberedelser
<ol>
	<li>Med 800 ng av fragmenterade genomiskt DNA i 45 µL avjoniserat vatten, lägga till 7 µL slutet-prep reaktion buffert (se Tabell för material), 3 µL enzym mix (se Tabell för material), och 5 µL nuclease gratis vatten.</li>
	<li>Blanda genom inversion och puls centrifug (1 000 x g för 5 s).</li>
	<li>Överför provet till en 0,2 mL tunnväggiga rör och inkubera provet för 5 min vid 20 ° C, följt av inkubation vid 65 ° C i 5 min.</li>
	<li>Pulse Centrifugera att föra innehållet till botten av röret.</li>
	<li>Överför provet till ett 1,5 mL låg-DNA bindande mikrocentrifug rör.</li>
	<li>Förbereda magnetiska pärlor (se tabell material). Lägga till 60 µL återsuspenderad pärlor i slutet prep reaktionen från steg 3.5 och mix av pipettering.</li>
	<li>Inkubera i en rotator mixer vid 100 rpm (se Tabell för material) under 5 minuter i rumstemperatur.</li>
	<li>Pulse Centrifugera provet till pellet pärlorna, sedan placera provet bredvid magnet.</li>
	<li>När pärlorna följs magneten, pipett av supernatanten och kassera.</li>
	<li>Ta bort röret från magnet och tvätta pärlorna med 200 µL av nylagade 70% etanol genom försiktigt pipettering provet up-and-down.</li>
	<li>Pulse Centrifugera pellet pärlorna och återvända till magneten.</li>
	<li>Avlägsna supernatanten och kassera. Upprepa tvätt igen med 200 µL av 70% etanol.</li>
	<li>Pulse Centrifugera röret, återgång till magneten och ta bort alla 70% etanol tvätten.</li>
	<li>Med mikrocentrifug rör locket öppet, låt pärlorna till luft torka för 5 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort röret från magnet och centrifugerade i 31 µL sterilt, nuclease-gratis vatten. Inkubera i 2 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Tillbaka röret till magneten tills alla pärlorna har pelleterats och eluatet är tydlig.</li>
	<li>Överföra eluatet till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Använder 1 µL prov, kvantifiera slutet-prepped DNA med en UV-spektrofotometer vid 260 nm (se Tabell för material). Obs: Procent återvinning ska vara ~ 70% (700 ng) från en start koncentration på 1 µg av genomisk DNA.</li>
</ol>
4. adapter och tjuder tillägg till slutet-prepped genomisk DNA-fragment
<ol>
	<li>Blanda alla de blunt/TA ligase huvudmixen rör genom inversion, och sedan puls centrifug för att få innehållet till botten.</li>
	<li>Använder 30 µL av slut-prepped DNA, tillsätt 20 µL av adapter mix och 50 µL av blunt/TA ligering master mix.</li>
	<li>Blanda genom inversion, puls centrifug, och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
</ol>
5. magnetiska Bead förberedelse
<ol>
	<li>Vortex pärlorna och sedan överföra 50 µL av svävande pärlor till en 1,5 mL microfuge röret.</li>
	<li>Placera röret på magneten till pellet pärlorna tills eluatet försvinner.</li>
	<li>Avlägsna supernatanten och kassera.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL av pärla bindande buffert (se Tabell av material för kornkit) till pärlor, vortex att resuspendera pärlorna, pellet pärlorna på magneten, avlägsna supernatanten och kassera. Upprepa tvätten med 100 µL av bindande buffert.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL av pärla bindande buffert till tvättade pärlorna. Vortex att resuspendera pärlorna.</li>
</ol>
6. bibliotek rening
<ol>
	<li>Använder en P200 mikropipett, tillsätt 40 µL pärlor från föregående steg i anpassas/uppbundna genomisk DNA. Blanda provet noggrant genom pipettering.</li>
	<li>Inkubera provet på en rotator mixer vid 100 rpm för 5 min i rumstemperatur.</li>
	<li>Placera provet på magneten och låt pärlorna sedimentera. Pipettera bort supernatanten och kassera.</li>
	<li>Återsuspendera pärlorna i 140 µL av pärla bindande buffert av pipettering. Placera provet mot magneten, avlägsna supernatanten och tvätta igen med en annan 140 µL av pärla bindande buffert.</li>
	<li>Pulse Centrifugera röret, placera röret på magneten för 2 min. ta bort återstående pärla bindande bufferten från pelleten.</li>
</ol>
7. eluering av biblioteket från Magnet pärlor
<ol>
	<li>Återsuspendera magnetiska pärlor i 15 µL eluering buffert av pipettering. Inkubera provet under 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Placera röret mot magneten till pellet pärlorna.</li></ol>När lösningen Clear, ta bort 15 µL av eluatet och överföring till ett 1,5 mL mikrofugrör och placera provet på is.
	<li>Kvantifiera biblioteket med en UV-spektrofotometer. Obs: Procent återvinning bör vara ~ 25% (250 ng) från en start koncentration på 1 µg av genomisk DNA.</li>

8. Starta en kör/kvalitetskontroll
<ol>
	<li>Ta bort cellen flöde ur förpackningen och koppla cellen flöde till bärbara, realtid sequencer (se Tabell för material).</li>
	<li>Fäst sequencer till en dator via USB-kabeln och starta programvaran sekvensering (se Tabell för material).</li>
	<li>Klicka på ”Anslut” enhet genom sekvensering programvara, Välj ”NC_Platform_QC.py” och klicka på ”Start”.</li>
	<li>Kvalitetskontroll (QC) tar cirka 6-7 min att slutföra; Leta upp ett ”hav av grön' (stora delar av produktionen) på QC utslaget att bekräfta att det finns tillräckligt aktiva porer (&#62; 800) för DNA-sekvensering.</li>
</ol>
9. Starta en sekvensering kör
<ol>
	<li>Öppna programmet sekvensering; en dialogruta visas. I rutan prov-ID namn provet.</li>
	<li>Klicka på rutan ”flöde Cell ID” och ange den kod som finns på etiketten på toppen av cellen flöde.</li>
	<li>Öppna flödet cell locket och sedan skjut prov port till höger (medsols) så att provet hamnen syns. När porten är öppen, kontrollera för en liten bubbla. Ta bort några mikroliter av buffert inklusive bubblan.</li>
	<li>Kontrollera att vara säker på att det råder buffert hela arrayen sensor. Gör priming bufferten genom att blanda 480 µL kör buffert med bränslemixen (RBF-1, se Tabell för material) (se till att blanda grundligt första) med 520 µL nuclease-gratis vatten.</li>
	<li>Tillsätt 800 µL av priming bufferten till port grundning. Lyft försiktigt luckan ”SpotOn” om du vill göra den tillgänglig.</li>
	<li>Efter 5 min, tillsätt en ytterligare 200 µL av priming buffert till port grundning.</li>
</ol>
10. lastning biblioteket
<ol>
	<li>Innan du förbereder bibliotek platsen följande reagenser på is: RBF-1 (från sekvensering kit), anpassat och uppbundna och biblioteket laddar pärlor (LLB; från sekvensering kit).</li>
	<li>Till ett 0,2 mL centrifugrör, lägga till 25,5 µL av RBF och 12 µL nuclease-fritt vatten vid rumstemperatur.</li>
	<li>Blanda LLB genom pipettering up-and-down. Tillsätt 26,5 µL av LLB till 0.2 µL röret. Blanda reagenserna genom pipettering up-and-down. Obs: LLB tenderar att kvitta ur blandningen.</li>
	<li>Tillsätt 11 µL av anpassade och uppbundna biblioteket till 0.2 µL röret. Blanda genom inversion och spinn genom puls centrifugering.</li>
	<li>Tillsätt 75 µL prov från steg 9,4 till ”SpotOn” porten droppvis. Se till att varje droppe flyter i porten innan du lägger till nästa.</li>
	<li>Noggrant sätt prov port bakstycket så att propp går in i porten och ersätta enheten locket.</li>
</ol>
11. Starta en sekvensering programvara protokoll skript
<ol>
	<li>Öppna den nedrullningsbara menyn under ”Välj Program' och välj” 48 timmars sekvensering ”.</li>
	<li>Klicka på knappen ”Kör” för att starta skriptet.</li>
	<li>Kontrollera resultaten av den Mux Skanna redovisas i anmälan ström för antalet aktiva porer i på MUX Skanna. Obs: Detta nummer kan skilja sig från antalet porer i QC kör och en stor skillnad kan tyda på ett problem.<ol>
		<li>Om det finns en betydande minskning av aktiva porer från QC flykt, starta om programvaran, och om det finns fortfarande en betydande skillnad, starta om datorn.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrollera att kylfläns temperaturen är 34 ° C som rapporterats av sekvensering programvara skriptet. Obs: Om temperaturen är inte på 34 ° C då det inte blir tillräckligt aktiva porer för körningen.</li>
	<li>Kolla histogrammet Läs längder att avgöra om sekvens längderna är beräknade och lämpliga för experimentell design.</li>
	<li>Stäng den desktop agent med 'close x.' Quit sekvensering programvaran genom att stänga ner webben GUI. Koppla bort enheten från datorn.</li>
</ol>
12. analys av kör och resultat
Obs: Under sekvensering flykt, data kan övervakas med hjälp av ”Visa rapport” programmet använda desktop agent. Under eller efter körningen är klar, filer finns i en FAST5 filformat i data → läser → passera mappen (standard). Om mappen är öppen medan sekvensering är aktiv, kan datorn låsa.
<ol>
	<li>Att visa och manipulera sekvenser, Ladda ner en ”HDFViewer”.</li>
	<li>Om du vill visa filerna sekvensering, direkt öppet HDF viewer → öppna Data mappen → Välj alla fil typer → Välj C: drive (standard) → Välj data → Välj läsningar → Välj pass.</li>
	<li>Hitta och välj filen FASTQ i den vänstra nedrullningsbara menyn; filer öppnas och kan sparas i FASTQ format. Obs: I syfte att student experimentet, sekvenser av 350 nukleotider eller längre valdes ut för vidare analys. Utdata från den bas kallelsen tillåter användaren att sortera sekvens läsningar utifrån storlek. FASTQ filer kan analyseras via BLAST (NCBI) eller andra program från bioinformatik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance.">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li><li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+metagenomics+identification+of+viral+pathogens+in+clinical+samples+by+real-time+nanopore+sequencing+analysis.">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99 (2015).</li><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella.">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114 (2015).</li><li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island.">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li><li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data.">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool.">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li><li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization.">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405 (2013).</li><li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li><li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore.">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li><li>Shendure, J., Hanlee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+DNA+sequencing.">Next generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Metagenomics+of+Soil.">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li></ol>

Författarna har inga upplysningar.

Många nästa generations sekvenseringsmetoder har genererats och varje beror på sekvensering av syntes men upptäckt plattformarna för att identifiera nukleotider skiljer sig åt. NS, det senaste tillskottet till marknadsplatsen, använder en annan metod helt, som inte kräver en sekvensering reaktion eller märkta nukleotider. Denna metod tar fördel av kostnad differential redan bildat nukleotider när de passerar genom en elektrifierad pore. Identifiering av varje nukleotid sker genom modulering av den elektriska strömmen genom de olika baserna när de passerar genom nanopore. Detta multiplexering system tillåter användaren att sekvensera många fragment i taget. Genom att sekvensera båda delarna av DNA, riktigheten av sekvensen ökas betydligt och den sekvensering programvara, som kan läsas på en bärbar dator, bearbetar signalerna och ger den information om aktivitetssekvens som kan analyseras.
I pyrosekvensering, en sekvensering av syntesmetod (SBS), beror påvisande av specifika basen införlivas med mallen på luciferas analysen och generering av Kemiluminiscens signaler8. I ion semiconductor sekvensering upptäcks den släppta vätejon, vilket minskar pH-värdet av en ion sensor9. Enda molekyl realtid sekvensering beror på noll läge wave guide (ZMW)10, som lyser upp för upptäckt en fluorescerande molekyl taggade till den inbyggda nukleotid. SBS använder en unik metod för att förstärka mål-DNA så att kluster av unika sekvenser är genererade13. Identifiering av den tillagda nukleotid uppnås när fluorescensen av den märkta nukleotid registreras. NS har däremot unik fördel gentemot andra metoder att det kräver begränsade tekniska resurser, är bärbar, producerar länge sekvensering läsningar, kräver ingen tidigare DNA-amplifiering och kan manövreras till lägre kostnad jämfört med andra metoder. Våra elever hittade det nya, Snabb bibliotek prep protokollet vara okomplicerad och mottaglig för en tre timmars lab klass. Några av de frågor som vi stött var bubblor i cellen flöde som var svåra att ta bort, det krävs betydande datorkraft (en terabyte lagringsutrymme), den nuvarande produktionen av data är i en FAST5 fil och sekvensering flöde cellen har en begränsad hållbarhet innan det försämras. Andra nackdelar av protokollet NS Ligation sekvensering (lång protocol) är dessutom att den kräver flera bibliotek förberedelser, kräver expertis inom molekylärbiologi tekniker och genererar reducerad sekvensering trohet jämfört med vissa sekvensering metoder3. Men senaste framstegen med den nya snabba bibliotek förberedelser kit kräver endast 10 min för bibliotek förberedelse och har visat en minskad sekvensering felprocent. Metoden för beredning av nya bibliotek var mycket mottagliga för användning i en lab-klass.
Det finns flera kritiska steg i protokollet, särskilt i QC av cellen flöde. Detta inkluderar utföra en inledande QC inom fem dagar efter mottagandet av cellen flöde och använder dem inom 8 veckor. Även om vi har använt flödesceller som var längre än 8 veckor, minskas avsevärt antalet öppna/aktiv porer. Det är viktigt att experiment planeras att passa en tidslinje där maximal användning av de flöde cellerna är uppnått. Vi har använt rengöring protokollet och återanvändas flödesceller med framgång.
Utreda metagenomik jord representerar en outnyttjad genetiska reservoar av mikrobiell mångfald. Exempelvis ett gram jord uppskattas innehålla mellan 107 - 109 prokaryota celler14. Dessutom, marklevande organismer är en huvudsaklig källa av romanen naturliga produkter, enzymer och antibiotika. Analys av DNA-sekvens i jord metagenomik utgör därmed, ett värdefullt pedagogiskt verktyg för studenter på varje utbildningsnivå. NS teknikens underlätta användning och låg kostnad gör detta system en mycket effektiv läromedel. Studenter kan sekvens miljöprover och efter slutförandet av sekvensen använda tillgängliga bioinformatiska verktyg att identifiera och karaktärisera mikrober och metagenomik sekvenser i proverna. Använda tekniken för NS, har studenter sanna praktisk erfarenhet, som har fram till nu varit av nå för användning i laboratorium kurser på grund av avancerad teknisk expertis och höga reagens, utrustning och underhåll kostnader i andra sekvensering plattformar. En av våra studenter (J. Harrison, personlig kommunikation) rapporterade nyligen, användningen av denna teknologi i ett miljöprojekt övervakning av gården jordar. Vi förväntar oss att det kommer att finnas många fler applikationer för denna teknik i utbildningen rymden.

Målet med detta förfarande är att visa de steg som krävs för beredning av en miljö DNA-bibliotek för sekvensering, utnyttjande av en nanopore flöde cell sekvensering enhet, och att utföra analys av de genererade DNA-sekvenser som använder systemprogramvaran och National Center for Biotechnology Information (NCBI) bioinformatiska verktyg att identifiera mikrobiell arter i jord. För närvarande, kräver de flesta DNA sekvensering plattformar en stor investering i teknisk utbildning och komplexa instrumentation, som inte är genomförbart i resurs fattiga miljöer eller i området tillämpningar. Nanopore sekvensering (NS) plattformen eliminerar problemen med en kostnadseffektiv, enkel att använda bibliotek förberedelse protokoll och en bärbar enhet att sekvensera och analysera en mängd olika typer av nukleinsyror1,3. Vi har införlivat NS plattformen i flera lab klasser för magisterexamen studenter.
Nanopore teknik för sekvensering biomolekyler har visat breda tillämpningar inom life science, inklusive identifiering av bakteriella och virala patogener1,2,6, miljömässiga biologisk mångfald studier, mat säkerhetsövervakning, genomanalys3,5och karakterisering av bakteriell resistens mot antibiotika4. NS är en snabb och noggrann metod för att sekvensen nukleinsyror som är baserad på principen om ”strand sekvensering” genom att upptäcka elektriska störningar av enskilda nucleotide baser när enda stranded DNA passerar genom en nanopore som infogas i en elektrifierad syntetisk polymer membran. De olika stegen i förberedelserna DNA för NS inkluderar genomet fragmentering, slutet reparation och 3' dA-tailing genomisk fragment, adapter och tjuder glödgning av DNA, DNA bibliotek rening och fylla på biblioteket i nanopore flöde cell enheten. Fragmentering av genomet in ~ 8 kb storlekar sker genom centrifugering 1-2 µg genomiskt DNA genom en g-tub fragmentering slang. Fragmenterade genomisk ändarna sedan repareras och stjärt med poly dA använder en kommersiellt tillgänglig kit. Enda stranded kort sekvenser, som är förenliga med nanopore motor proteinet, läggs till DNA-ändarna som används för att vägleda den DNA-sekvensen genom nanopore (figur 1). Tjuder sekvenser krävs för DNA-rening och lokalisera DNA-molekylerna till pore membranet. Hårnål genereras av ligating en hårnål-adaptern till ena änden av dA tailed biblioteket. Hårnål strukturerna i DNA-ändarna tillåter läsning av förnuft och antisense strandar DNA passerar genom nanopore (figur 2). Den beredda genombibliotek renas sedan från reaktionen med hjälp av streptividin pärlor med hjälp av ett magnetfält, följt av lastning provet i cellen nanopore flöde för analys.
Sekvenserade DNA bedöms för kvalitet och sekvensering läsningar som är godtagbara för analys utsätts sedan för flera bioinformatiska verktyg att identifiera mikrober. Sekvenserna översätts ”” till en FASTQ från ett FAST5 format. I formatet FASTQ, kan sekvenser sedan användas i BLAST analys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:625px;" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:124px;">LifeECO</td>
			<td style="width:119px;">BTC42096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Covaris g-TUBE</td>
			<td style="width:124px;">Covaris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">520079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">E7546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyOne C1 Strepavidin Beads</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Model 5420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop UV spectrophotometer</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td>Model 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power Soil DNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:124px;">MO BIO</td>
			<td style="width:119px;">12888-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ligation Sequencing Kit 2D</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-LSK208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td>
			<td style="width:124px;">New England BioLab</td>
			<td style="width:119px;">MO367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AmPure XP Magnetic Beads</td>
			<td style="width:124px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basic Starter Pack&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Includes MinION&#160; Sequencing Device and Flow Cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinKNOW software</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA</td>
			<td style="width:124px;">Oxford Nanopore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SQK-RAD002</td>
			<td style="width:167px;">Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopore dna sequencing for metagenomic soil analysis

Denna artikel beskriver stegen för byggandet av ett DNA-bibliotek från jord, beredning och användning av cellen nanopore flöde, och analys av de DNA-sekvenser som identifieras med hjälp av datorprogram. Nanopore DNA-sekvensering är en flexibel teknik som möjliggör snabb mikrobiell Genomsekvensering att identifiera bakteriella och virala arter, att karakterisera bakteriestammar och upptäcka genetiska mutationer som ger resistens mot antibiotika. Fördelarna med nanopore ordningsföljd (NS) för biovetenskap är dess låg komplexitet, minskad kostnad och snabb realtid sekvensering av renat genomiskt DNA, PCR-amplikoner, cDNA prover eller RNA. NS är ett exempel på ”strand sekvensering” som innebär sekvensering DNA genom att styra en enda stranded DNA molekyl genom en nanopore som är infogat i en syntetisk polymer membran. Membranet har en elektrisk ström som tillämpas i hela det, så som de enskilda grunderna passera genom nanopore den elektriska strömmen störs i varierande grad av de fyra nucleotide baserna. Identifiering av varje nukleotid uppstår genom att upptäcka den karakteristiska moduleringen av den elektriska strömmen av de olika baserna när de passerar genom nanopore. NS systemet består av en handenhet, USB powered bärbar enhet och en disponibel flöde cell som innehåller en nanopore matris. Den bärbara enheten ansluts till en vanlig bärbar dator som läser och registrerar den DNA-sekvens som använder datorprogram.

Den experimentella design och nanopore tekniken som en snabb och billig metod för studenter att jord DNA-sekvens. Den representativa kör passerade parametrarna kvalitetskontroll med mer än 800 porer tillgängliga för sekvensering. Körningen resulterade i över 125 000 läsningar tillgängliga för studien med en median sekvens längd på 5,38 kb. Sekvenser ges ett kvalitetsresultat och endast dessa sekvenser med acceptabelt resultat analyserades sedan. Under produktionen av sekvensering är reaktion i FAST5 format, som inte accepteras av program såsom BLAST (NCBI), sekvenser visades i visningsprogrammet HDF som konverterar sekvenser till FASTQ format, som är kompatibel för BLAST analys. I framtida iterationer av programvaran, data blir tillgängliga som ett FASTQ format, vilket eliminerar behovet av HDF betraktaren. Se kompletterande siffrorna 1, 2 och 3.
Femtio sekvenser av över 350 nukleotider i längd var föremål för analys av BLASTN (nukleotider mot nukleotid-databas) eller BLASTX (nukleotider översatt till aminosyrasekvens) (NCBI) att identifiera organismer i jordprov. Tanke på tid begränsningar i klassen och att kursen fokuserar på laboratoriemetoder och inte bioinformatik, vi har eleverna analysera sekvenser inom dessa parametrar. Våra bioinformatik klasser kan använda data för utveckling av rörledning analysverktyg. Denna nivå av bioinformatik analys omfattas inte i klassen laboratorium baserat. Tabell 1 är en lista över de organismer som identifierades med e värden på mindre än 4 e-04. E-värden som är mindre än 4 e-04 i allmänhet, visar stora likheter mellan ingående sekvensen (fråga) och matchade sekvensen. De organismer som identifierats av BLASTN (mot icke-redundant (nr)-databasen) är från en mängd olika arter och är tillgängliga för ytterligare genomisk och protein analyser. Detta urval av smutsa, som kom från en trädgård i Baltimore County, MD hade aldrig testats, så det fanns ingen tidigare data att avgöra vad organismer kan vara i marken. BLASTN analys (mot nr databasen) analysen visade också det fanns sekvenser med inga likheter i databasen nr. För att avgöra om dessa är verkligen roman sekvenser, behövs ytterligare en studie. Analysen av flera sekvenser av BLASTX visade flera proteiner från organismer inte representerade i BLASTN analys. Tabell 2 visar flera möjliga proteiner, inklusive typ och ATPases-liknande proteiner. Studenter använder detta bibliotek av sekvenser, och har möjlighet att använda mer sofistikerade bioinformatiska verktyg för att utföra ytterligare analyser, om regisserad av instruktören.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figur 1 : Genombibliotek förberedelse. Steg för förberedelse av genombibliotek DNA för sekvensering med nanopore teknik. Denna siffra har modifierats med nödvändiga behörigheter. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figur 2 . Schematisk av DNA-sekvensering med hjälp av en nanopore. DNA som passerar genom ett nanopore membran med elektrisk signal generation och base identifiering. Denna siffra har modifierats med nödvändiga behörigheter. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismen</td>
			<td>e värdet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0, 00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: vald BLASTN analysresultaten. Smutsar metagenomik DNA-sekvenser som utsätts för BLASTN likheten Sök mot NCBI icke-redundant nukleotid-databasen. De rapporterade uppgifterna har e-värden 4 x e-4 eller mindre.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein</td>
			<td>Organismen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotetiska protein</td>
			<td>Acidobacter bakterien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM beroende metyltransferas</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPas</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidase</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis protein</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: vald BLASTX analysresultaten. Smutsar metagenomik DNA-sekvenser som utsätts för BLASTX likheten Sök mot NCBI icke-redundant protein databasen.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Kompletterande Figur1: plattform QC resultat. Resultaten av plattformen QC presenteras. I det övre högra hörnet är resultaten av QC för aktiva porer. Varje kvadrant av cellen flöde är testad för aktiva porer. Huvudsidan är dynamisk och ändras medan varje kvadrant är testad. I denna springa upptäcktes 1.414 enda porer.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Kompletterande figur 2: konvertera FAST5 filer till FASTQ filer. Här är till höger, produktionen av data från den sekvensering kör. Varje rad representerar en enskild sekvens. Till vänster i figuren visar den markerade sekvensen från höger sida, i HDF viewer som konverterar sekvensen till en FASTQ-fil som kan användas för vidare analys. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Kompletterande figur 3: exempel av FASTQ sekvens i HDF viewer. Denna sekvens (Läs 803) är i en FASTQ-fil som omvandlar FAST5 data till nukleotider. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis at JoVE.com

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore teknik för sekvensering biomolekyler har breda tillämpningar inom life science, inklusive identifiering av patogener, mat säkerhetsövervakning, genomanalys, metagenomic miljöövervakning och karakterisering av bakteriell antibiotikaresistens. I denna artikel demonstreras förfarandet för gjorts jord DNA-sekvensering för artbestämning med hjälp av nanopore sekvensering teknik.

Nanopore DNA-sekvensering för gjorts Jordanalys

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Research

JoVE Journal

Environment

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Design och drift av en kontinuerlig<sup&gt; 13</sup&gt; C och<sup&gt; 15</sup&gt; N Märkning avdelningen för Uniform eller Differential, Metabolic och struktur, växt Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Experimentell Protokoll för Manipulera växt-inducerad Soil Heterogenitet

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Luft samplade Filter Analys för endotoxiner och DNA-innehåll

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data

Extrahera Metrics för Tredimensionella rotsystem: Volym och ytanalys från In-mark röntgen Datortomografi Data

Plant roots play a critical role in plant-soil-microbe interactions that occur in the rhizosphere, as well as processes with important implications to ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Ett protokoll för insamling och konstruera Jord Kärn lysimetrarna

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

En invikta Thermogradient tabell att kontrollera Jord Temperaturer för att utvärdera Växternas tillväxt och övervakning mark

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Protokoll för att kvantifiera överlåtbara bekämpningsmedelsrester i turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

En lipid extraktions- och analysmetod för karakterisering av markmikrober i experiment med många prov

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mätning och kartläggning mönster jorderosion och nedfall kopplad till jord karbonat koncentrationer Under jordbrukets förvaltning

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...