Name: methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e una donazione di beneficenza per la ricerca sulla SLA da Thomas Lawson, per cui siamo grati. Ringraziamo Elysse Orchard e Donna Burney per consulenza e formazione. JAS è stata sostenuta dalla Fondazione ha mentito e National Institutes of Health concedere GM103418.

tutte le procedure seguite le opportune linee guida NIH. Tutte le procedure di seguito protocolli degli animali che sono stati approvati dal comitato di utilizzo LSU Health Sciences Center a Shreveport e cura degli animali. Ratti Sprague-Dawley femminili a 6 settimane dell'età sono stati utilizzati per questa procedura.
 1. determinare le dosi/volumi del vettore necessaria <ol><li>pesare i ratti per essere iniettato e determinare la quantità di vettore virale necessari per ogni animale ba...

<ol>
	<li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed.">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li><li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats.">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+targeting,+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B.">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats.">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+vector+&amp;#34;magic+bullet&amp;#34;:+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter.">Gene vector &amp;#34;magic bullet&amp;#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li><li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+embolism:+pathophysiology+and+treatment.">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li></ol>

Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l'introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagant...

Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l'iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 questo approccio di consegna del gene viene utilizzato nei ratti per esprimere in modo efficiente una proteina fluorescente verde (GFP) o l'ALS ha collegato la proteina, transactive risposta DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43) nel SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 lavorando in ratti è significativo perché i parametri fisiologici e metabolici del ratto sono più vicini agli esseri umani rispetto ai topi e ci sono le analisi tossicologiche e comportamentali progettate specificamente per i ratti. Inoltre, altre linee di ratto transgenico stanno diventando disponibili che possono essere utilizzati in studi di trasferimento del gene AAV.
Metodi sono dettagliate per il trasferimento del gene CNS espansiva nel ratto e quantificazione rapida, affidabile dei risultati. Trasduzione CNS su vasta scala è usato per imitare la sintomatologia di ALS in ratti esprimendo TDP-43 in tutto il midollo spinale. Il metodo è coda vena iniezioni di TDP-43 vector per giovani ratti adulti come usato in Jackson et al. 6 , 8 , 9 dopo diverse settimane, i deficit del motore indotta da TDP-43 sono segnati con due metodi: fuga reflex e rotarod come usato in Dayton et al e Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 per il vettore GFP di controllo, nelle analisi post-mortem, zona fluorescente del cervelletto è calcolata come un indice di efficienza di trasduzione come usato in Jackson et al. 6 , 8 l'analisi del cervelletto ha dimostrato di essere un indice rapido e affidabile del grado di trasduzione CNS dopo la consegna del gene periferico e dovrebbe essere applicabile a una varietà di approcci di tentare di trasferimento genico centro-periferico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Pelouze</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bucket</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12014000</td>
			<td>4000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>0338-0114-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>128101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22624415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td>Comes with a 25g needle attached. 
			Replace with 27-30g needle for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>66794-013-25</td>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia mask</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-2524</td>
			<td>2&#34; x 2&#34; (5cm x 5cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>4214322</td>
			<td>Classic T3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia scavenger</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>32373B10</td>
			<td>Enviro-PURE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sears</td>
			<td>17280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56617-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>Panlab/Harvard Apparatus</td>
			<td>76-0772</td>
			<td>4 rats/ 4 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2401</td>
			<td>140 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89108-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scion Image</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td>Primary Antibody - 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary Antibody - 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 40 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction

Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l'investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l'intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l'importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L'uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.

TDP-43 motorie indotte dovrebbero sorgere entro 2-6 settimane a seconda della dose dell'AAV TDP-43 utilizzato (Figura 1). Iniezioni di vena infruttuoso coda si tradurrà in parziale o nessuna disabilità; l'AAV deve raggiungere il flusso sanguigno per produrre l'effetto. Un'iniezione di successo di AAV GFP si tradurrà nell'espressione di GFP in tutto il cervello e il midollo spinale in modo vettoriale-dose dipendente. Quando si utilizza il promotore ricombin...

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Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

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