Name: methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction
Uploaded: 2017-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx og en veldedig donasjon for ALS forskning fra Thomas Lawson, som vi er takknemlige. Vi takker Elysse frukthage og Donna Burney for råd og opplæring. JAS ble støttet av løy Foundation og National Institutes of Health gir GM103418.

alle prosedyrer fulgt riktig NIH retningslinjene. Alle prosedyrer fulgte dyr protokoller som ble godkjent av Animal Care og bruk komité i LSU Health Sciences Center i Shreveport. Sprague-Dawley hunnrotter for 6 ukens av alderen ble brukt for denne prosedyren.
 1. fastslå doser/mengder vektor nødvendig <ol><li>veie rotter injiseres og bestemme mengden av viral vektor nødvendig for hvert dyr basert på titer (konsentrasjon) av vektor preparatet. Bruke vektor doser som har vært vellykket ...

<ol>
	<li>Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li><li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons.">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li><li>Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansive+gene+transfer+in+the+rat+CNS+rapidly+produces+amyotrophic+lateral+sclerosis+relevant+sequelae+when+TDP-43+is+overexpressed.">Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed.</a> Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).</li><li>Dayton, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+forelimb+impairment+in+rats+expressing+a+pathological+TDP-43+25+kDa+C-terminal+fragment+to+mimic+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis.</a> Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV9+supports+wide-scale+transduction+of+the+CNS+and+TDP-43+disease+modeling+in+adult+rats.">AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats.</a> Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+targeting,+better+efficiency+for+wide-scale+neuronal+transduction+with+the+synapsin+promoter+and+AAV-PHP.B.">Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B.</a> Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).</li><li>Jackson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+respiratory+changes+at+end+stage+in+a+FUS-induced+disease+state+in+adult+rats.">Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+vector+&amp;#34;magic+bullet&amp;#34;:+targeted+expression+in+the+central+nervous+system+after+peripheral+delivery+using+the+synapsin+promoter.">Gene vector &amp;#34;magic bullet&amp;#34;: targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).</li><li>van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+embolism:+pathophysiology+and+treatment.">Gas embolism: pathophysiology and treatment.</a> Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).</li></ol>

En rekke levering ruter er testet for AAV vektorer: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intravenøs, intranasal, intra-muskuløse, etc. Hver rute kan ha bestemte fordeler samt ulemper. Hale blodåre administrasjon av AAV voksen rotter er en pålitelig metode for å oppnå konsistente Albin på CNS. Eksterne injeksjon metoden unngår innføring av en injeksjon kanyle i CNS vev og er derfor minimal invasiv. Effektiv CNS uttrykket som kan oppnås ved denne metoden er den største fordelen med teknikke...

Rekombinant adeno-assosiert virus (AAV) vektorer er uunnværlige verktøy for CNS forskning fordi de er så effektiv for transducing nerveceller i vivo. AAV vektorer er svært allsidig for å studere ulike effekter av transgener og protein isoformene, ulike vev, andre arter og ulike bruksmåter. For eksempel kan AAV administreres til mus av en enhet, relativt ikke-invasiv, intravenøs injeksjon til transduce nerveceller i CNS som første beskrevet i Foust et al. og Duque et al. (se JOVE papir av Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 denne gen levering brukes i rotter effektivt uttrykke enten grønne fluorescerende protein (GFP) eller ALS protein, transactive svar DNA-bindende protein av 43 kDa (TDP-43) i CNS. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 arbeider i rotter er viktig fordi det rotten fysiologiske og metabolske parametere er nærmere mennesker i forhold til mus og opptreden og toksikologiske analyser laget spesielt for rotter. Videre transgene rotte linjer blir tilgjengelig som kan benyttes i AAV genet overføring studier.
Metodene vises detaljert for ekspansive CNS genoverføring rotta og rask, pålitelig kvantifisering av resultatene. Bred CNS signaltransduksjon brukes til å etterligne symptomer av ALS i rotter ved å uttrykke TDP-43 gjennom ryggmargen. Metoden er halen blodåre injeksjoner av TDP-43 vektoren unge voksne rotter som brukes i Jackson et al. 6 , 8 , 9 etter ukene TDP-43-indusert motor underskudd er scoret to metoder: unnslippe refleks og rotarod som brukes i Dayton et al. og Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 for kontroll GFP vektor, post mortem analyse, fluorescerende området av lillehjernen beregnes som en indeks av signaltransduksjon effektivitet i Jackson et al. 6 , 8 analyse av lillehjernen har vist seg for å være en rask og pålitelig indeks av graden av CNS signaltransduksjon etter eksterne gen levering og skal kunne brukes til en rekke tilnærminger forsøker enhet-til-sentrale genoverføring.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Pelouze</td>
			<td>SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bucket</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12014000</td>
			<td>4000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>0338-0114-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>128101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22624415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309626</td>
			<td>Comes with a 25g needle attached. 
			Replace with 27-30g needle for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30g needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>66794-013-25</td>
			<td>Isoflurane USP 250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia mask</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-2524</td>
			<td>2&#34; x 2&#34; (5cm x 5cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>4214322</td>
			<td>Classic T3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia scavenger</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>32373B10</td>
			<td>Enviro-PURE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sears</td>
			<td>17280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56617-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>Panlab/Harvard Apparatus</td>
			<td>76-0772</td>
			<td>4 rats/ 4 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2401</td>
			<td>140 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Isopropanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89108-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scion Image</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td>Primary Antibody - 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11070</td>
			<td>Secondary Antibody - 1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 40 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction

Adeno-assosiert virus (AAV) vektorer er en nøkkel reagens i neurosciences for gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR), optogenetics, grobunn-lox målretting, etc. Hensikten med denne oppgaven er å hjelpe etterforskeren forsøker ekspansive sentralnervesystemet (CNS) genoverføring i rotte via hale blodåre injeksjon av AAV. Bred uttrykket er relevante for forhold med utbredt patologi, og en rotte modell er viktig på grunn av sin størrelse og fysiologiske likheter med human sammenlignet med mus. I dette eksemplet programmet brukes en bred neuronal signaltransduksjon til å etterligne en nevrodegenerative sykdommer som påvirker hele ryggmargen, amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Effektiv bred CNS signaltransduksjon kan også brukes til å levere terapeutiske protein faktorer i pre kliniske studier. Etter et etter injeksjon uttrykk intervall flere uker evalueres effekten av signaltransduksjon. For en grønn fluorescerende protein (GFP) kontroll vektor anslås mengden GFP i lillehjernen raskt og pålitelig ved en grunnleggende bildebehandlingsprogrammet. For motor sykdom fenotyper hjulpet av ALS relaterte protein transactive svar DNA-bindende protein av 43 kDa (TDP-43), scoret underskuddene escape refleks og rotarod. Utover sykdommen modellering og genterapi finnes det ulike mulige programmer for bred genet målretting beskrevet her. Utvidet bruk av denne metoden vil hjelpe å påskynde hypotesetesting i nevrovitenskap og neurogenetics.

TDP-43 indusert motor impairments skulle oppstå innen 2-6 uker avhengig av dose av AAV TDP-43 som brukes (figur 1). Mislykket hale blodåre injeksjoner vil resultere i delvis eller ingen nedskrivninger; AAV må nå blodet å produsere effekten. En vellykket injeksjon av AAV GFP vil føre GFP uttrykk i hjernen og ryggmarg på vector-dose avhengige måte. Når du bruker sterk rekombinant arrangøren til stasjonen uttrykk, cytomegalovirus kylling beta begrepsor...

Watch this Scientific Journal Video about Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction at JoVE.com

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Metoder og tupper for intravenøs administrasjon av Adeno-assosiert Virus rotter og evaluering av sentralnervesystemet signaltransduksjon

Metoder for en bred sentralnervesystemet gen levering rotta er dekket. I dette eksemplet er hensikten å etterligne en sykdom som påvirker hele ryggmargen. Den utbredt signaltransduksjon kan brukes til å levere en terapeutisk protein til CNS fra en engangs, ekstern administrasjon.

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Metoder for Intravenøs Selv Administration i en mus modell

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunhistokjemisk analyse i Rat sentralnervesystemet og perifer lymfeknute vevsdelene

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funksjonell Evaluering av biologisk nervegifter i Nettbaserte Kulturer av Stem Cell-avledet sentralnervesystemet nevroner

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...