Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
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我々は、従来のUVランプを備えたUV架橋装置を提供したJoris Winderickx教授の研究室を認めている。 KGはKUルーベン研究基金の支援を受けており、FWOグラントG065713Nの支援を受けています。

1. シロイヌナズナ葉メゾフィルスプロトプラストの単離注： シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、Yoo et al 。、2007に記載されているように、いくつかの改変40を伴って本質的に単離される。 <ol><li> 植物の成長 <ol><li> シロイヌナズナ Col-0種子の種子を約200個滅菌水に4℃で2日間浸漬して層別します。 ...

我々は、酵母およびヒト細胞のために開発されたmRNA相互作用捕獲を植物葉の葉の葉のプロトプラストに首尾よく適用した。リーフ葉肉細胞は、植物の葉における地上組織の主要なタイプである。この方法の主な利点は、生理学的環境からタンパク質を発見するためにインビボ架橋を使用することである。 このプロトコルでは、我々は、主に最適化された実?...

真核生物は、細胞の生物学的プロセスを維持するために複数のRNA生合成調節経路を使用する。 RNAの既知のタイプのうち、mRNAが非常に多様であり、タンパク質のコード容量を運び、それらのアイソフォーム1つの選択図PTGR経路は、プレmRNA 2,3の運命を指示します。異なる遺伝子ファミリーからのRBPがRNAの調節を制御し、PTGRにおいて、特定のmRBPは機能的なmRNPを形成する直接的な物理的相互作用を介してmRNAを誘導する。したがって、mRBPsおよびそれらmRNPsを同定および特徴づけることは過去30年間.Over細胞mRNA代謝2の調節を理解するために重要であり、種々のインビトロ法- RNA電気泳動移動度シフト（REMSA）アッセイ、指数関数的濃縮アッセイによるリガンドの系統的進化含みますライブラリー由来の構築物、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性標識または定量的標識蛍光RNA結合アッセイ、X線結晶学、及びNMR分光法は、4、5、6、7、8、9 -広く主に哺乳動物細胞から、RBPsの研究に適用されています。哺乳動物RBPのこれらの研究の結果は、公開された観察を収集するRNA結合タンパク質データベース（RBPDB）を介して検索することができる10 。 これらのインビトロアプローチは強力なツールであるが、所定のRNAプールからの結合RNAモチーフを決定するため、新しい標的RNAを発見する能力には限界がある。タンパク質配列および構造の保存に基づくゲノム全体のRBPを予測するための計算戦略についても同様である15 。これを克服するために、新しい実験方法ha目的のRBPが相互作用するRNAモチーフの同定を可能にし、結合の正確な位置の決定を可能にする。 「架橋および免疫沈降」（CLIP）と呼ばれるこの方法は、インビボ UV架橋およびその後の免疫沈降11からなる 。初期の研究では、DNAおよびRNAヌクレオチドの光活性化は、245nmを超える励起UV波長で起こり得ることが示されている。チミジンを介した反応が好ましいと思われる（光反応性の減少の順にランク：dT≧dC&gt; rU&gt; rC、dA、dG） 12 。波長254nm（UV-C）のUV光を用いて、数オングストローム（Å）の範囲でRNAヌクレオチドとタンパク質残基との間の共有結合が形成されることが観察された。したがって、この現象は、RNAおよびRBPの「ゼロ長」架橋と呼ばれている。これに続いて、厳格な精製手順<html>少し背景13、14とdure。 CLIPに相補的な戦略は、インビボ UV架橋とタンパク質同定とを組み合わせて RBPの景観を記述することである。そのようなゲノムワイドなmRNAの結合プロテオームの数は、「のmRNAインタラクトームキャプチャ」18と呼ばれるこの新規な実験的アプローチを用いて、酵母細胞、胚性幹細胞（ESC）、およびヒト細胞株（ 例えば、HEK293及びHeLa細胞）から単離されています19、20、21。この方法は、インビボ UV架橋、続いてmRNP精製およびMSに基づくプロテオミクスからなる。この戦略を適用することによって、非カノニカルRBDを含む多くの新規の「月明かり」RBPが発見されており、以前よりも多くのタンパク質がRNA結合能力を有することが明らかになった「&gt; 15、16、17は 、この方法を使用することは、新しいアプリケーションやRBPsを調査する際、新たな生物学的な質問に答える能力が可能になります。例えば、最近の研究では、mRNA結合プロテオーム（コアRBPの保全を検討していますプロテオーム） 22 。 プラントRBPsはすでに成長と開発に関与することが見出されている（ 例えば 、ミトコンドリアと葉緑体における開花時期の転写後調節、概日時計、および遺伝子発現に）24、25、26、27、28、29 。さらに、それらは、非生物的ストレス（ 例えば、寒さ、干ばつ、sa）に応答する細胞プロセスにおいて機能を果たすと考えられているlinity、およびアブシジン酸（ABA））31、32、33、34。 RNA認識モチーフ（RRM）およびKホモロジー（KH）ドメイン配列モチーフに基づいて、 シロイヌナズナゲノム中に200を超える予測されたRBP遺伝子が存在する。イネにおいて、約250 35、36を注目されています。多くの予測されたRBPが、植物に独特であるようである（ 例えば、 RRMドメインを含む予測シロイヌナズナ RBPの約50％に対するメタアゾーンオーソログはない） 35 、これは多くが新しい機能を果たし得ることを示唆している。最も予測されたRBPの機能は特徴付けされていない23 。 シロイヌナズナ由来のmRNA結合プロテオームの単離は、苗木、葉組織、培養根細胞、および葉の葉肉プロトプラストを、mRNAインタラクトームキャプチャは最近、38、39に報告されています。これらの研究は、近い将来植物における機能的RBPを体系的に分類する強力な可能性を実証している。ここで、我々は、植物プロトプラスト（ すなわち、細胞壁を有さない細胞）からのmRNA相互作用の捕獲のためのプロトコールを提示する。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、葉の細胞の主要なタイプである。単離されたプロトプラストは、細胞へのUV光の最適なアクセスを可能にする。この細胞型は一過機能的特徴40、41タンパク質を発現アッセイにおいて使用され得ます。また、プロトプラストは、いくつかの他の植物細胞型および種42、43、44に印加されている（ 例えば、ピーターソンら 、2009; Bargmannとバーンバウム2010;および香港ら 、2012）。 &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt;このメソッドには合計11のステップが含まれています（ 図1A ）。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストを最初に単離し（ステップ1）、次にUV照射して架橋したmRNPを形成する（ステップ2）。プロトプラストを変性条件下で溶解すると（ステップ3）、架橋されたmRNPは溶解/結合緩衝液中に放出され、オリゴd（T） 25ビーズによって引き下げられる（ステップ4）。数回のストリンジェントな洗浄の後、mRNPを精製し、さらに分析する。 mRBPの変性ペプチドをプロテイナーゼKで消化してから、架橋したmRNAを精製し、RNA品質をqRT-PCR（ステップ5および6）によって確認する。 RNase処理およびタンパク質濃度（ステップ7）の後、タンパク質の品質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および銀染色（ステップ8）によって制御される。タンパク質バンドパターンの違いは、架橋サンプル（CL）と非架橋サンプル（非CL;非架橋サンプル）との間で容易に視覚化することができる。UV照射を受けていないプロトプラストからの陰性対照試料）。タンパク質の同定は、MSに基づくプロテオミクスによって達成される。可能性のあるバックグラウンド汚染を除去するために、1次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1D-PAGE）によってCLサンプルからのタンパク質を分離し、トリプシンを用いて短いペプチドに「ゲル内消化」し、精製する（工程9）。質量分析（ナノLC-MS）に結合されたナノ逆相液体クロマトグラフィーは、mRNA結合プロテオームにおける決定的なタンパク質の量の決定を可能にする（工程10）。最後に、同定されたmRBPを特徴付け、バイオインフォマティクス分析を用いてカタログ化する（ステップ11）。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA結合タンパク質（RBP）はRNAの運命を決定する。それらはすべてのRNA生合成経路に関与し、特にメッセンジャーRNA（mRNA）の転写後遺伝子調節（PTGR）に寄与する。ここ数年、酵母および哺乳動物細胞株由来の多数のmRNA結合プロテオームが、mRNA結合タンパク質（mRBP）の同定を可能にする「mRNAインタラクトーム捕捉」と呼ばれる新規な方法の使用によって首尾よく単離された。生理学的環境から直接的に得ることができる。この方法は、オリゴ（dT）ビーズによるメッセンジャーリボ核タンパク質複合体（mRNP）のin vivo紫外線（UV）架橋、プルダウンおよび精製、およびその後の質量分析（MS）による架橋タンパク質の同定からなる。非常に最近、同じ方法を適用することによって、いくつかの植物のmRNA結合プロテオームが異なるシロイヌナズナ組織源から同時に報告されている：幼植物、葉組織、葉の葉肉プロトプラスト、および培養された根細胞を含む。ここでは、 シロイヌナズナ葉の葉の葉の葉のプロトプラストの最適化されたmRNAインタラクトムキャプチャー法を紹介します。このプロトプラストは、様々な細胞アッセイを含む実験の汎用ツールとして機能する細胞タイプです。最適タンパク質収量の条件は、出発組織の量およびUV照射の持続時間を含む。中規模実験（10 7細胞）から得られたmRNA結合プロテオームにおいて、RNA結合能を有することが示されたRBPが過剰発現され、多くの新規なRBPが同定された。実験はスケールアップ（10 9細胞）することができ、最適化された方法は、植物のmRNA結合プロテオームを広く単離し、カタログ化し、比較するために、他の植物細胞型および種に適用することができる。

我々は、洗浄緩衝液2（ 図1B ）を用いた洗浄工程4.3において、CL試料中のビーズペレットを囲む特徴的なハローを観察した。それは調査されていないが、この現象は、磁気捕獲中に架橋したmRNP複合体がビーズ凝集と干渉し、より拡散した凝集体を形成することによって、おそらく説明できる。これは、オリゴ-d（T） 25ビーズ捕捉が有効で...

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeqのための実験デザイン：トウモロコシ葉の開発の分析からの教訓

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

(CARIC) 戦略をキャプチャするキャプチャとクリック化学支援 RNA インタラクトームを用いた RNA 結合タンパク質の同定

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...