Name: electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

लेखक हमें अंश के लिए अपने केंद्रापसारक का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ एरिक सी बोल्तों धंयवाद और डॉ ग्राहम एच Diering है जॉन हॉपकिंस विश्वविद्यालय में डॉ रिचर्ड एल Huganir लैब में हमें छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल के साथ प्रदान करने के लिए PSD अंश के लिए ।

पशु विषयों सहित सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं Urbana-Champaign पर इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. एक चूहा कॉलोनी बनाए रखने
<ol><li>नस्ल Sprague...

यहां, हम चूहों में एक ईसीएस प्रेरण पद्धति का वर्णन है कि उनके hippocampi में न्यूरॉन गतिविधि के वैश्विक उत्तेजना बटोरता है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी के एक पशु मॉडल है, जो नैदानिक मानव में दवा दुर्दम्य अवसादग्रस्त?...

Electroconvulsive चिकित्सा गंभीर दवा प्रतिरोधी अवसाद, द्विध्रुवी अवसाद, पार्किंसंस रोग, और एक प्रकार का पागलपन1,2सहित प्रमुख अवसादग्रस्तता विकारों के साथ रोगियों का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस चिकित्सा में, जब्ती विद्युत उत्तेजना epicranial इलेक्ट्रोड के माध्यम से anesthetized रोगियों के सिर को दिया द्वारा उत्पन्न होता है1,2,3. ईसीएस के दोहराव प्रशासन चिकित्सकीय दवा प्रतिरोधी अवसादग्रस्तता विकारों के लिए फायदेमंद रहा है1,2,3। हालांकि, मानव में एंटी इफेक्ट की दीर्घकालिक प्रभावकारिता अंतर्निहित सटीक तंत्र मायावी बनी हुई है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी का एक पशु मॉडल है और इसकी चिकित्सीय व्यवस्था की जांच के लिए व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । कुतर में, दोनों तीव्र ईसीएस और जीर्ण ईसीएस उपचार hippocampi में वयस्क neurogenesis को बढ़ावा देने और तंत्रिका नेटवर्क को पुनर्गठित4,5, जो संज्ञानात्मक लचीलेपन में सुधार करने के लिए योगदान करने की संभावना है । इसके अलावा, ईसीएस द्वारा मस्तिष्क गतिविधि के वैश्विक उन्नयन इस तरह के एक मस्तिष्क व्युत्पंन neurotropic कारक के रूप में टेप की बहुतायत बदल जाता है6, और metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर 17 और एन मिथाइल-डी-aspartate सहित कई प्रोटीन, (एनएमडीए) प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर7यूनिटों । इन परिवर्तनों को हिप्पोकैंपस में synapse संख्या, संरचना, और शक्ति की लंबी अवधि के संशोधन मध्यस्थता में शामिल कर रहे हैं7,8,9।
ईसीएस मॉडल में, बिजली की उत्तेजना stereotaxically प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड, corneal इलेक्ट्रोड, या कान इलेक्ट्रोड के माध्यम से कुतर दिया है सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी10,11पैदा करने के लिए । इलेक्ट्रोड के Stereotaxic आरोपण मस्तिष्क शल्य चिकित्सा शामिल है और चोट को कम करने के लिए प्रयोगकर्ता शल्य चिकित्सा कौशल में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता है । कम इनवेसिव corneal इलेक्ट्रोड corneal घर्षण और सूखापन पैदा कर सकता है और संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है । कान क्लिप इलेक्ट्रोड का उपयोग इन सीमाओं को दरकिनार क्योंकि वे सर्जरी या संज्ञाहरण के बिना कुतर पर इस्तेमाल किया जा सकता है और न्यूनतम चोट का कारण । दरअसल, हमने पाया है कि वर्तमान कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से जाग चूहों को दिया मज़बूती से स्टेज 4-5 टॉनिक-क्लोनिंग बरामदगी और उनके hippocampi10में synaptic प्रोटीन बदल जाता है ।
synaptic प्रोटीन के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में ईसीएस प्रेरित बहुतायत की जांच करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक तरीकों कि उनके पता लगाने और ठहराव के लिए सबसे उपयुक्त है का चयन करने के लिए । मस्तिष्क की सेल् फी घुलनशील cytosolic प्रोटीन के क्रूड अलगाव के लिए अनुमति देता है; झिल्ली प्रोटीन; organelle-सीमा प्रोटीन; और भी विशेष उपसेलुलर संरचनाओं में प्रोटीन, जैसे PSD12,13,14। PSD एक घने और अच्छी तरह का आयोजन किया है, जिसमें synaptic प्रोटीन अत्यधिक और postsynaptic झिल्ली के पास पर केंद्रित कर रहे है ंयूरॉंस में सेलुलर डोमेन12,13,15। psd के अलगाव synaptic प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयोगी psd पर समृद्ध है, बहुतायत और postsynaptic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, मचान प्रोटीन के समारोह में गतिशील परिवर्तन के बाद से, और संकेत transduction प्रोटीन में12 psd , 15 , 16 , 17 synaptic प्लास्टिक और synaptopathy कई स्नायविक विकारों17,18में मनाया के साथ संबंधित हैं । एक पिछले उपसेलुलर अंश विधि सुक्रोज ढाल14के अंतर केंद्रापसारक द्वारा मस्तिष्क के कच्चे झिल्ली अंश से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश के अलगाव शामिल PSD को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया, 19. इस पारंपरिक विधि के साथ प्रमुख चुनौती यह है कि इसे कुतर दिमाग की बड़ी मात्रा14,19की आवश्यकता है । 10-20 कुतर के उपचार प्रति PSD अंश को अलग करने की तैयारी व्यापक लागत और समय निवेश की आवश्यकता है और व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है अगर वहां कई उपचार कर रहे हैं ।
इस चुनौती को दूर करने के लिए, हम एक सरल तरीका है कि सीधे psd अंश को अलग अनुकूलित किया है, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक20,21के बिना, और यह संशोधित करने के लिए एक ही चूहे की hippocampi से psd अलगाव लागू हो मस्तिष्क. हमारे छोटे पैमाने psd अंश विधि 2 hippocampi से psd प्रोटीन के 30-50 µ जी के बारे में पैदावार, कई जैव रासायनिक परख में उपयोग के लिए पर्याप्त immunoprecipitation और पश्चिमी सोख्ता सहित, । पश्चिमी सोख्ता postsynaptic घनत्व प्रोटीन ९५ (psd-९५) और presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin के बहिष्कार के संवर्धन खुलासा द्वारा PSD अलग करने के लिए हमारी विधि की सफलता दर्शाता है । हमारे ईसीएस प्रेरण और छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण तरीकों आसानी से अन्य कुतर मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलनीय हैं और PSD प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर ईसीएस के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1047">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Spargue-Dawley rat</td>
			<td style="width:245px;">Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:224px;">ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">A pulse generator</td>
			<td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td>
			<td>57800</td>
			<td>ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MilliQ water purifying system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Z00Q0VWW</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Em science</td>
			<td>SX 1075-3</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na4O7P2</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>221368</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H0527</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1136</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Halt Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaVO3</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72060</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Iris Scissors</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments)</td>
			<td>500216-G</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">30 mm tissue culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Glass homogenizer and a Teflon pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89026-384</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>C2170 (1001002)</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:433px;">Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004521</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#23228</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#1859078</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#4561086S</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Running Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:433px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&#160;</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Transfer Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>436143</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent for PSD isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Mini Trans-Blot Module&#160;</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703935</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Nonfat instant dry milk</td>
			<td>Great value</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Multi-purposee rotator&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model-2314</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Hyblot CL Autoradiography Film</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>E3018 (1001365)</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Enhanced chemifluorescence substrate&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">a Konica SRX-101A film processor</td>
			<td>KONICA MINOLTA</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Name of Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">PSD-95</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2507</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Synaptophysin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#4329</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">alpha-Tubulin</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-5286</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluN2B</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>75-097</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluA2</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>Sab 4501295</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">STEP</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-23892</td>
			<td>Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins

Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) Electroconvulsive चिकित्सा, गंभीर अवसाद के लिए सबसे प्रभावी उपचार का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस कम मृत्यु दर और न्यूरॉन की मौत के साथ सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी और विरोधी मिरगी दवाओं स्क्रीन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल है लाती है । यहां, हम एक ईसीएस प्रेरण विधि का वर्णन जिसमें एक संक्षिप्त ५५-mA वर्तमान ०.५ एस के लिए पुरुष चूहों २००-२५० जी के लिए वजन में कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया है । इस तरह के द्विपक्षीय उत्तेजना चरण 4-5 क्लोनल बरामदगी है कि के बारे में पिछले 10 एस का उत्पादन किया । तीव्र या जीर्ण ईसीएस की समाप्ति के बाद, ज्यादातर चूहों को शर्मसार "नहीं जब्ती" चूहों से व्यवहार से अलग हो बरामद किया । क्योंकि ईसीएस दुनिया भर में मस्तिष्क गतिविधि तरक्की, यह भी synaptic प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर परिवर्तन और synaptic शक्ति कई तरीकों का उपयोग कर अपने प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, postsynaptic घनत्व के उपसेलुलर भिन्नीकरण (PSD) पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में इस विशेष synaptic संरचना में synaptic प्रोटीन की बहुतायत के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देता है. एक पिछले अंश विधि है कि कुतर दिमाग की बड़ी राशि की आवश्यकता के विपरीत, हम यहां का वर्णन एक छोटे पैमाने पर भिन्नीकरण विधि एक एकल चूहे के hippocampi से PSD को अलग करने के लिए, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक के बिना । इस विधि का प्रयोग, हम बताते है कि अलग PSD अंश postsynaptic झिल्ली प्रोटीन, PSD95, GluN2B, और GluA2 सहित शामिल हैं । Presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin psd अंश से बाहर रखा गया था, सफल psd अलगाव का प्रदर्शन । इसके अलावा, पुरानी ईसीएस psd में GluN2B अभिव्यक्ति की कमी हुई, यह दर्शाता है कि हमारे छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण विधि आनुवंशिक, औषधीय, या यांत्रिक उपचार के बाद एक भी चूहे से हिप्पोकैम्पस PSD प्रोटीन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता .

विस्तृत प्रक्रिया का प्रयोग यहां प्रस्तुत, एक बिजली के झटके (५५ mA, १०० पल्स एस ०.५ s के लिए/कान के माध्यम से दिया क्लिप इलेक्ट्रोड-चूहों में आवर्ती चरण 4-5 टॉनिक-क्लोनल बरामदगी प्रेरित (च...

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Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) गंभीर अवसाद के लिए Electroconvulsive चिकित्सा का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस वैश्विक रूप से हिप्पोकैंपस में गतिविधि को उत्तेजित करता है, synaptogenesis और synaptic प्लास्टिक के लिए अग्रणी । यहां, हम चूहों में ईसीएस प्रेरण के लिए तरीकों का वर्णन और उनके hippocampi के सेलुलर अंश के लिए synaptic प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच ।

चूहों और उनके Hippocampi के अंश में Electroconvulsive बरामदगी Postsynaptic घनत्व प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

The overall goal of the electroconvlusive seizure induction and subsequent smallscale fractionation of hippocampus is to induce global seizure activity in the rat brain, and to examine seizure activity induced alterations of proteins in the postsynaptic density of the hippocampus. This method can help answer key questions in the neural process of the film, such as which snaptic proteins are regulated in specific brain regions upon seizure, and whether such regulation can contribute to neuroplasticity. The main advantage of this electroconvulsive seizure induction protocol is that we can lively induce lo-bal allevation of law-dons brain activity without neuronal death.Demonstrating the procedure will be myself and Han Gil Jeong from Dr.Hee Jung Chung's laboratory. To begin this procedure, place a male rat in a clean, empty cage with a lid. Let the rat habituate for 30 minutes, then, set the pulse generator for ECS induction.Prepare the pulse generator by pushing the reset button and ensure that the ready button is lit. Make sure that the ear clips are not attached to the pulse generator. Next, press the shock button for a few seconds, then, plug the ear clips into the pulse generator.In this step, wet the ear clips with sterile saline and ensure that they are saturated. Next, wet the rat's ears with sterile saline by wrapping them in saline soaked gauze. Once they are wet, remove the gauze.Attach the clips to the ears at one clip per ear and position them beyond the main cartilage band. Press the shock button for a few seconds and observe the seizure. For the sham, no seizure control, treat the rat identically, but do not deliver the current.As clonus begins, disconnect the ear clips and record the seizure behavior according to a revised, Racine scale of one to five. This includes rearing with four limb clonus at stage four, and rearing and falling with four limb clonus at stage five. The seizure should last approximately 10 seconds.Record the seizure duration using a timer. Following seizure termination, return the rat to its home cage. Monitor the rat for another five minutes to make sure of its recovery from the seizures.Keep it singly housed in the cage, and return the cage to the recovery room. In this procedure, place two hippocampi from one rat onto a 30 milometer tissue culture dish and mince them into small pieces using scissors. After that, transfer the minced hippocampi to a manual glass homogenizer and add one milliliter of iced cold homogenization buffer.Next, insert a round pecil into a glass homogenizer. While the glass homogenizer is on ice, gently and steadily stroke up and down on the pecil, 10 to 15 times for one minute until small pieces of hippocampal tissue disappear. Then, transfer the homogenote to a 1.7 milometer microcentrifuge tube using a one milometer pipet and centrifuge the homogenote at 800 times G for 10 minutes at four degrees Celsius to separate the post nuclear supernatant from the pellet containing insoluble tissue and nuclei.Afterward, transfer 50 microliters and 950 microliters of the S1 fraction to two separate new 1.7 milliliter microcentrifuge tubes and store these tubes on ice. Also, save the P1 fraction pellet on ice. Subsequently, centrifuge the 950 microliter S1 fraction for 10 minutes at 13, 800 times G and four degrees Celsius to separate the supernatant enriched with cytosolic soluble proteins and the pellet enriched with membrane bound proteins, including synaptosomal proteins.Transfer the S2 fraction to a new 1.7 milliliter microcentrifuge and store it on ice. Following that, resuspend the P2 fraction pellet in 498 microliters of ice cold purified water. Add two microliters of one molar heeps to achieve a final concentration of four millimolar heeps.Incubate the suspension at four degrees Celsius with agitation for 30 minutes. After 30 minutes, store the resuspended P2 fraction on ice. In this step, centrifuge the P2 fraction for 20 minutes at 25, 000 times G and four degrees Celsius to separate the lysed supernatant and the lysed pellet.Transfer the LS2 fraction to a new 1.7 milliliter microcentrifuge tube and store it on ice. Then, resuspend the LP1 pellet in 250 microliters at 50 millimolar heeps, mixed with 250 microliters of one percent detergent, and 1 X PBS. Incubate the suspension at four degrees Celsius with gentle agitation for 15 minutes.Afterward, centrifuge the resuspended LP1 pellet for 3 hours at 25, 000 times G and four degrees Celsius to separate the non PSD fraction supernatant from the PSD fraction pellet. Remove the supernatant to a 1.7 milliliter microcentrifuge tube and resuspend the PSD pellet in 100 microliters of 50 millimolar heeps. In this figure, the representative western blots show the protein expression of NMDA receptive subunit GluN2B, ampa receptor, GluA2, and STEP 61 in the S2, P2, and PSD fractions from the hippocampi of sham, no seizure rats, and rats that received acute ECS.The cytoplasmic soluble protein alpha-Tubulin is enriched in the S2 fraction. Synaptophysin is a presynaptic vesicle protein and is enriched in the crude membrane P2 fraction but not in the PSD fraction, whereas PSD-95 is enriched in both the P2 and PSD fractions. Shown here, are the quantification of GluN2B and GluA2 in the P2 and PSD fractions at three and 24 hours after acute ECS.GluN2B and GluA2 expression in the P2 fraction was normalized to alpha-Tubulin in the S2 fraction. In GluN2B and GluA2 expression in the PSD fraction, was normalized to PSD 95 in the PSD fraction. Once mastered, this technique can be done in five to six hours if it is performed properly.Following this procedure, auto-masser like mass, spector-metry, based on protein mix can be performed in order to answer additional questions, what other synaptic proteins are altered by ECS. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of neurological disease to explore the underlying mechanism of synaptic dysfunction in order for act of law-dons, trans-gen-ing motors of neurological diseases. After watching this video, you should have a good understanding of how to induce the ECS in law-dons, perform homogenization and PSD fractionation from the hippocampi and to examine alterations of synaptic proteins after ECS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

एक असंतत सुक्रोज ढाल का उपयोग Synaptic प्लाज्मा झिल्ली और postsynaptic घनत्व प्रोटीन की तैयारी

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

चूहे के मस्तिष्क ऊतक में जांच करने के लिए छंटनी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग सेल प्रकार विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

मनुष्यों में कोर्टिकोटोनूरोनल ट्रांसमिशन में परिवर्तन के गैर-आक्रामक आकलन

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

एक साथ दो-फोटान<em&gt; Vivo</em&gt; माउस Retrosplenial कोर्टेक्स में अन्तर्ग्रथनी आदानों की इमेजिंग और postsynaptic लक्ष्य

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

ऑप्टिकल फ्रेक्चरेटर तकनीक, इलेक्ट्रोकोनिवल्सी थेरेपी के चूहा मॉडल में सेल नंबर का अनुमान लगाने के लिए

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Anesthetized चूहों में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जोड़तोड़ के जवाब में गुर्दे सहानुभूति तंत्रिका गतिविधि में तीव्र परिवर्तन को बढ़ाता है

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

चूहों में इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन का मात्रात्मक माप

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...