Name: electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Eric C. Bolton för att tillåta oss att använda hans centrifug för fraktionering och Dr Graham H. Diering i Dr Richard L. Huganir lab vid John Hopkins University för att förse oss med småskaliga protokollet för den PSD fraktioneringen.

Alla experimentella rutiner inklusive animaliska ämnen har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Illinois at Urbana-Champaign.
1. att upprätthålla en råtta koloni
<ol><li>Häcka Sprague-Dawley-råttor (se Tabell av material) och underhålla dem i normala förhållanden med en 12-h ljus-mörker cykel och ad lib tillgång till mat och vatten.</li>
	<li>Avvänja råttungar vid postnatal dag (P) 28 och hus dem i grupper om 2...

Här beskriver vi ett ECS induktion metod hos råttor som framkallar den globala stimuleringen av neuronal aktivitet i deras hippocampi. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, som används kliniskt för behandling drog behandlingsresistenta depressiva störningar i människor1,2,3. Trots användning av elektrokonvulsiv terapi för att behandla svår depression, oklar den exakta underliggande mekanismen. Eftersom ECS...

Elektrokonvulsiv terapi har använts för att behandla patienter med stora depressiva störningar, inklusive svår resistent depression, bipolär depression, Parkinsons sjukdomar och schizofreni1,2. I denna behandling genereras beslag av elektrisk stimulans levereras till chefen för sövda patienter via epicranial elektroder1,2,3. Upprepad administrering av ECS har gynnat kliniskt resistenta depressiva störningar1,2,3. Den exakta mekanismen bakom den långsiktiga effekten av antidepressiva effekten hos människa har dock förblivit svårfångade. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi och används ofta för att undersöka dess terapeutiska mekanism. Hos gnagare, både akut ECS och långtidsbehandling med ECS främja adult neurogenes i hippocampi och omorganisera den neurala nätverk4,5, som sannolikt kommer att bidra till förbättringar i kognitiv flexibilitet. Dessutom förändrar global förhöjning av hjärnans aktivitet av ECS överflödet av avskrifter, såsom en hjärna härrör neurotropa faktor6och flera proteiner, inklusive metabotropa glutamat receptor 17 och den N-metyl-D-aspartat (NMDA) typ glutamat receptor subenheter7. Dessa förändringar är inblandade i medla långsiktig ändring av synaps nummer, struktur och styrka i hippocampus7,8,9.
I ECS modeller levereras elektrisk stimulering till gnagare via stereotaxically implanterade elektroder, korneal elektroder eller örat elektroder att framkalla generaliserade tonisk-kloniska anfall10,11. Stereotaxic implantation av elektroder innebär hjärnkirurgi och kräver betydande tid att förbättra de experimenter's kirurgiska färdigheter för att minimera skadan. Mindre invasiva korneal elektroder kan orsaka korneal nötning och torrhet och kräver narkos. Användning av örat-clip elektroder kringgår dessa begränsningar eftersom de kan användas på gnagare utan kirurgi eller anestesi och minimal skada. Faktiskt, fann vi att nuvarande levereras till vaken råttor via örat-clip elektroder tillförlitligt inducerar etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall och förändrar synaptic proteiner i deras hippocampi10.
För att undersöka ECS-inducerad överflödet av synaptic proteiner i de delar av hjärnan av gnagare, är det viktigt att välja de experimentella metoder som är mest lämpade för deras upptäckt och kvantifiering. Subcellulär fraktionering av hjärnan tillåter för råolja isolering av lösliga cytosoliska proteiner; membranproteiner; organell-bounds proteiner; och även proteiner i särskilda subcellulära strukturer, såsom PSD12,13,14. PSD är en tät och väl organiserad subcellulär domän i nervceller där synaptic proteiner är starkt koncentrerad vid och nära den postsynaptiska membran12,13,15. Isolering av PSD är användbart för studiet av synaptic proteiner berikad på PSD, sedan dynamiska förändringar i överflöd och funktion av postsynaptiska glutamatreceptorer, byggnadsställningar proteiner och signaltransduktion proteiner i PSD12 , 15 , 16 , 17 är korrelerade med synaptisk plasticitet och den synaptopathy som observerats i flera neurologiska17,18. En tidigare subcellulär fraktionering metod som används för att rena PSD inblandade isoleringen av den olösliga i tvättmedel fraktionen från rå membran fraktionen av hjärnan genom den differentiella centrifugeringen av sackaros lutningar14, 19. den stora utmaningen med denna traditionella metod är att den kräver stora mängder gnagare brains14,19. Beredning av 10-20 gnagare att isolera den PSD fraktionen per behandling kräver omfattande kostnads- och investering i tid och är inte praktiskt genomförbart om det finns många behandlingar.
För att övervinna denna utmaning, har vi anpassat en enklare metod som direkt isolerar den PSD fraktionen, utan sackaros gradient centrifugering20,21, och revideras för att vara tillämplig på PSD isolering från hippocampi på en enda råtta hjärnan. Våra småskaliga PSD fraktionering metod ger om 30-50 µg av PSD proteiner från 2 hippocampi, tillräckligt för användning i flera biokemiska analyser, inklusive immunoprecipitation och Western blotting. Western blotting visar framgången av vår metod för att isolera PSD genom att avslöja anrikningen av postsynaptiska densitet protein 95 (PSD-95) och uteslutandet av presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin. Våra ECS induktion och småskaliga PSD fraktionering metoder är lätt att anpassa till andra gnagare hjärnan och ger en relativt enkel och pålitlig sätt att utvärdera effekterna av ECS på uttrycket av PSD proteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1047">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Spargue-Dawley rat</td>
			<td style="width:245px;">Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:224px;">ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">A pulse generator</td>
			<td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td>
			<td>57800</td>
			<td>ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MilliQ water purifying system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Z00Q0VWW</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Em science</td>
			<td>SX 1075-3</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na4O7P2</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>221368</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H0527</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1136</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Halt Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaVO3</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72060</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Iris Scissors</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments)</td>
			<td>500216-G</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">30 mm tissue culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Glass homogenizer and a Teflon pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89026-384</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>C2170 (1001002)</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:433px;">Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004521</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#23228</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#1859078</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#4561086S</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Running Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:433px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&#160;</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Transfer Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>436143</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent for PSD isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Mini Trans-Blot Module&#160;</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703935</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Nonfat instant dry milk</td>
			<td>Great value</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Multi-purposee rotator&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model-2314</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Hyblot CL Autoradiography Film</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>E3018 (1001365)</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Enhanced chemifluorescence substrate&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">a Konica SRX-101A film processor</td>
			<td>KONICA MINOLTA</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Name of Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">PSD-95</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2507</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Synaptophysin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#4329</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">alpha-Tubulin</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-5286</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluN2B</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>75-097</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluA2</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>Sab 4501295</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">STEP</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-23892</td>
			<td>Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins

Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, den mest effektiva behandlingen för svår depression. ECS inducerar generaliserade tonisk-kloniska anfall med låg mortalitet och neuronala dödsfall och är en allmänt använd modell till skärmen antiepileptika. Här, vi beskriver en metod för induktion av ECS i som en kort 55-mA ström levereras för 0,5 s till manliga råttor 200-250 g i vikt via örat-clip elektroder. Sådana bilaterala stimulering produceras stage 4-5 kloniska anfall som varade ca 10 s. Efter upphörande av akut eller kronisk ECS, de flesta råttor återhämtat sig för att vara behaviorally omöjlig att skilja från sham ”inga beslag” råttor. Eftersom ECS globalt höjer hjärnans aktivitet, har det också använts för att undersöka aktivitet-beroende förändringar av synaptic proteiner och deras effekter på synaptisk styrka med flera metoder. I synnerhet tillåter subcellulär fraktionering av postsynaptiska densiteten (PSD) i kombination med Western blotting för kvantitativ bestämning av överflödet av synaptic proteiner vid denna specialiserade synaptic struktur. I motsats till en föregående fraktionering metod som kräver stor mängd gnagare hjärnor, beskriver vi här en småskalig fraktionering metod för att isolera PSD från hippocampi på en enda råtta, utan sackaros gradient centrifugering. Med den här metoden visar vi att den isolera PSD-fraktionen innehåller postsynaptiska membranproteiner, inklusive PSD95, GluN2B och GluA2. Presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin uteslöts från den PSD fraktionen, demonstrerar framgångsrika PSD isolering. Kronisk ECS minskade dessutom GluN2B uttryck i PSD, som visar att vår småskaliga PSD fraktionering metod kan användas för att upptäcka förändringar i hippocampus PSD proteiner från en enda råtta efter genetiska, farmakologiska eller mekaniska behandlingar .

Med hjälp av detaljerad procedur presenteras här, en elektrisk stöt (55 mA, 100 pulser/s för 0,5 s) levereras via örat-clip elektroder inducerad engångsposter steg 4-5 tonisk-kloniska anfall hos råttor (figur 1A-B). En totalt 8 råttor emot akut ECS induktion och visas etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall. Beslagen varade ca 10 s, och alla råttor återhämtade sig inom 1-2 min beslag upphörande. Skenmanöver ”inga beslag” råttor få...

Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi vid svår depression. ECS stimulerar globalt aktiviteten i hippocampus, vilket leder till synaptogenes och synaptisk plasticitet. Här, beskriver vi metoder för ECS induktion hos råttor och subcellulär fraktionering av deras hippocampi att undersöka beslag-inducerade förändringar i synaptic proteiner.

Elektrokonvulsiv anfall hos råttor och fraktionering av deras Hippocampi att undersöka beslag-inducerade förändringar i postsynaptiska densitet proteiner

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

The overall goal of the electroconvlusive seizure induction and subsequent smallscale fractionation of hippocampus is to induce global seizure activity in the rat brain, and to examine seizure activity induced alterations of proteins in the postsynaptic density of the hippocampus. This method can help answer key questions in the neural process of the film, such as which snaptic proteins are regulated in specific brain regions upon seizure, and whether such regulation can contribute to neuroplasticity. The main advantage of this electroconvulsive seizure induction protocol is that we can lively induce lo-bal allevation of law-dons brain activity without neuronal death.Demonstrating the procedure will be myself and Han Gil Jeong from Dr.Hee Jung Chung's laboratory. To begin this procedure, place a male rat in a clean, empty cage with a lid. Let the rat habituate for 30 minutes, then, set the pulse generator for ECS induction.Prepare the pulse generator by pushing the reset button and ensure that the ready button is lit. Make sure that the ear clips are not attached to the pulse generator. Next, press the shock button for a few seconds, then, plug the ear clips into the pulse generator.In this step, wet the ear clips with sterile saline and ensure that they are saturated. Next, wet the rat's ears with sterile saline by wrapping them in saline soaked gauze. Once they are wet, remove the gauze.Attach the clips to the ears at one clip per ear and position them beyond the main cartilage band. Press the shock button for a few seconds and observe the seizure. For the sham, no seizure control, treat the rat identically, but do not deliver the current.As clonus begins, disconnect the ear clips and record the seizure behavior according to a revised, Racine scale of one to five. This includes rearing with four limb clonus at stage four, and rearing and falling with four limb clonus at stage five. The seizure should last approximately 10 seconds.Record the seizure duration using a timer. Following seizure termination, return the rat to its home cage. Monitor the rat for another five minutes to make sure of its recovery from the seizures.Keep it singly housed in the cage, and return the cage to the recovery room. In this procedure, place two hippocampi from one rat onto a 30 milometer tissue culture dish and mince them into small pieces using scissors. After that, transfer the minced hippocampi to a manual glass homogenizer and add one milliliter of iced cold homogenization buffer.Next, insert a round pecil into a glass homogenizer. While the glass homogenizer is on ice, gently and steadily stroke up and down on the pecil, 10 to 15 times for one minute until small pieces of hippocampal tissue disappear. Then, transfer the homogenote to a 1.7 milometer microcentrifuge tube using a one milometer pipet and centrifuge the homogenote at 800 times G for 10 minutes at four degrees Celsius to separate the post nuclear supernatant from the pellet containing insoluble tissue and nuclei.Afterward, transfer 50 microliters and 950 microliters of the S1 fraction to two separate new 1.7 milliliter microcentrifuge tubes and store these tubes on ice. Also, save the P1 fraction pellet on ice. Subsequently, centrifuge the 950 microliter S1 fraction for 10 minutes at 13, 800 times G and four degrees Celsius to separate the supernatant enriched with cytosolic soluble proteins and the pellet enriched with membrane bound proteins, including synaptosomal proteins.Transfer the S2 fraction to a new 1.7 milliliter microcentrifuge and store it on ice. Following that, resuspend the P2 fraction pellet in 498 microliters of ice cold purified water. Add two microliters of one molar heeps to achieve a final concentration of four millimolar heeps.Incubate the suspension at four degrees Celsius with agitation for 30 minutes. After 30 minutes, store the resuspended P2 fraction on ice. In this step, centrifuge the P2 fraction for 20 minutes at 25, 000 times G and four degrees Celsius to separate the lysed supernatant and the lysed pellet.Transfer the LS2 fraction to a new 1.7 milliliter microcentrifuge tube and store it on ice. Then, resuspend the LP1 pellet in 250 microliters at 50 millimolar heeps, mixed with 250 microliters of one percent detergent, and 1 X PBS. Incubate the suspension at four degrees Celsius with gentle agitation for 15 minutes.Afterward, centrifuge the resuspended LP1 pellet for 3 hours at 25, 000 times G and four degrees Celsius to separate the non PSD fraction supernatant from the PSD fraction pellet. Remove the supernatant to a 1.7 milliliter microcentrifuge tube and resuspend the PSD pellet in 100 microliters of 50 millimolar heeps. In this figure, the representative western blots show the protein expression of NMDA receptive subunit GluN2B, ampa receptor, GluA2, and STEP 61 in the S2, P2, and PSD fractions from the hippocampi of sham, no seizure rats, and rats that received acute ECS.The cytoplasmic soluble protein alpha-Tubulin is enriched in the S2 fraction. Synaptophysin is a presynaptic vesicle protein and is enriched in the crude membrane P2 fraction but not in the PSD fraction, whereas PSD-95 is enriched in both the P2 and PSD fractions. Shown here, are the quantification of GluN2B and GluA2 in the P2 and PSD fractions at three and 24 hours after acute ECS.GluN2B and GluA2 expression in the P2 fraction was normalized to alpha-Tubulin in the S2 fraction. In GluN2B and GluA2 expression in the PSD fraction, was normalized to PSD 95 in the PSD fraction. Once mastered, this technique can be done in five to six hours if it is performed properly.Following this procedure, auto-masser like mass, spector-metry, based on protein mix can be performed in order to answer additional questions, what other synaptic proteins are altered by ECS. After its development, this technique paved the way for researchers in the field of neurological disease to explore the underlying mechanism of synaptic dysfunction in order for act of law-dons, trans-gen-ing motors of neurological diseases. After watching this video, you should have a good understanding of how to induce the ECS in law-dons, perform homogenization and PSD fractionation from the hippocampi and to examine alterations of synaptic proteins after ECS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

En allmän metod för att utvärdera Inkubation av Sackaros Craving på råttor

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

Icke-invasiv bedömning av förändringar i kortikomotonuronal överföring hos människor

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Samtidig Två-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av synaptiska inmatningar och postsynaptiska mål i mus Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Den optiska fraktioneringstekniken för att beräkna cellnummer i en råttmodell för elektrokonvulsiv terapi

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Kvantifiera akuta förändringar i Renal sympatisk nervaktivitet svar på centrala nervsystemet manipulationer hos sövda råttor

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Kvantitativ mätning av intratekalt syntetiserade proteiner hos möss

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...