Name: horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00
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Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d&#39;opportunités avancées SciMed GRS par l&#39;intermédiaire de l&#39;École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l&#39;Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).

1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal 4 . <ol><li> Préparation des matériaux nécessaires. <ol><li> Pour l&#39;appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément. </li><li> Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8...

<ol>
	<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels.">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3.">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li><li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions.">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li><li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus.">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li><li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain.">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li><li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein.">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li><li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators.">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).</li><li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C.">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li><li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis,+cytoskeletal+organization,+and+its+own+expression.">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs.">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li><li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal+C,+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies,+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow.">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li><li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity.">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li><li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays.">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li></ol>

Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , <sup cla...

Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l&#39;affinité de liaison des protéines à l&#39;ARN ou à l&#39;ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l&#39;ARN par des expériences de compétition de substrat 1 . La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d&#39;ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d&#39;une électrophorèse d&#39;échantillon dans un appareil vertical 3. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n&#39;est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l&#39;analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l&#39;appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l&#39;électrophorèse 3 , 4 . Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d&#39;ARN marqués par fluorescence 4 , 5 , 6 , 7 . L&#39;incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d&#39;échantillons simultanément 4 . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d&#39;ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d&#39;ARN et à les discriminer à partir de substrat d&#39;ARN non lié.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1432">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Horizontal Gel Box</td>
			<td style="width:112px;">OWL</td>
			<td style="width:116px;">N/A</td>
			<td style="width:831px;">Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td>
			<td>OWL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerpac 300</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APS</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNAs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein labeled RNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Order can be made custom to length and desired sequence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA tetrasodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5391-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>T8600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483 12 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes

L&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l&#39;analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l&#39;horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d&#39;ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l&#39;électrophorèse progresse. Cela fournit l&#39;occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l&#39;expérience. De plus, l&#39;électrophorèse sur gel horizontale permet d&#39;analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.

Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l&#39;électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l&#39;ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux 9,</...

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Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

L&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l&#39;électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l&#39;utilisation d&#39;électrophorèse sur gel horizontal horizontal.

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

The overall of this protocol is to analyze RNA protein interactions using horizontal native gel electrophoresis. This method can help answer key questions in RNA biochemistry, such as defining the characteristics of specific RNA protein interactions. The main advantage of this technique is that it allows complex formation to be monitored multiple times during electrophoresis.For the horizontal gel apparatus, use a gel box with a 27 centimeter by 21 centimeter casting tray and a capacity for two 24 well combs. This set up provides a total of 48 samples that can be analyzed simultaneously. Prepare two liters of 1x TBE running buffer by diluting 400 milliliters of 5x TBE with 1, 600 milliliters of water and mixing.Place the TBE buffer in the cold room to cool. Prepare the following reagents following standard procedures, 40%acrylamide best 19:1, 5x TBE, temed and 10%ammonium per sulfate. To make a 10%native acrylamide gel, add the following to a 500 milliliter flask:80 milliliters of 5x TBE, 100 milliliters of 40%acrylamide and water to a final volume of 400 milliliters.Add four milliliters of 10%ammonium per sulfate and 400 microliters of temed and mix well. Pour the mix into the horizontal casting tray and allow the gel to polymerize in the fume hood for 30 minutes. The polymerized gel will be approximately two centimeters thick and a thin layer of liquid will remain on top of the gel.Place the gel into the gel box and take it into the cold room. Next, pour the liquid off and rinse with running buffer. Remove the combs carefully, add two liters of cold running buffer to the gel box and then use a syringe to rinse the wells with running buffer.Pre-run the gel at 120 volts for one hour at four degrees celsius in a cold room. While the gel is being prerun, prepare the binding reactions. Add the following binding reaction components to each RNA free microcentrifuge tube in this order:five microliters of 10 millimolar BSA, five microliters of 20 millimolar DTT, five microliters of 10 millimolar yeast tRNAs, 10 microliters of 5x binding buffer, bicaudal-c protein to a final concentration of 250 nanomolar in 50 microliters, DEPC-treated water to a final volume of 45 microliters and five microliters of fluorescently labeled RNA substrate.Close the tubes and flick gently to mix, centrifuge the tubes briefly and incubate in the dark for 30 minutes at room temperature. When the binding reactions are complete, add 15 microliters of 50%glycerol to each reaction and mix gently. Carefully load 30 microliters of each reaction into the wells of the gel, the amount of sample that can be loaded into a single well varies depending on the thickness of the gel and the size of the wells.The power supply to the gel apparatus, switch on the power, adjust the voltage to 120 volts and run the gel in four degree celsius. To prevent damaging or bleaching of the fluorescently labeled RNA, conduct electrophoresis in the dark. Electrophoresis times will vary depending upon the specifics of the RNA protein complex being analyzed.A major advantage of the horizontal electrophorated mobility shift assay analysis, is that electrophoresis can be stopped in the gel image prior to completion of the run. Perform analysis with any instrument designed for detecting an imaging fluorescent substrates. Adjust the imager settings, for fluorescently labeled ligands, use the following settings.Fluorescein wavelength of 473 nanometers, photomultiplier voltage of 750 volts and pixel size of 100 micrometers. Scan the gel to capture the image. After imaging, the gel can be placed back into the apparatus and electrophoresis can be continued for longer times.The binding of the xenopus bicaudal-C or Bicc1 protein to a fluorescently labeled Cripto1 mRNA containing a Bicc1 binding site, was analyzed by both vertical and horizontal native gel electrophoresis, as a negative control, Bicc1 was mixed with a fluorescently labeled RNA derived from CyclinB1 mRNA. It was readily apparent using either method, that Bicc1 binds to the Cripto1 RNA and forms a specific complex. However, the Bicc1, Cripto1 complexes were significantly more distinct when analyzed with the horizontal gel, facilitating their detection and allowing the discrimination of protein RNA complexes from unbound RNA.After imaging, the gel was returned to the gel apparatus, electrophoresis for an additional three and a half hours, and reimaged. As shown here, the complexes had migrated further and were still readily detectable, indicating their stability. Once mastered, this technique can be done in four to five hours, if it is performed properly.After watching this video, you should have a good understanding of how to analyze RNA protein interactions using horizontal native gel electrophoresis.

Research

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