Name: horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes at JoVE.com

אנו מודים לורה Vanderploeg להכנת דמויות. עבודה במעבדה Sheets נתמך על ידי מענק NSF 1050395 ומענק NIH (R21HD076828). עבודה במעבדה ריידר נתמכת על ידי מענקים NIH R01GM117237 ו R01GM117008. מייגן Dowdle נתמכת על ידי מלגת GRS SciMed הזדמנות מתקדמת באמצעות אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון בוגר בית הספר ותוכנית ביוטכנולוגיה הדרכה באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM008349).

1. הכנת ג &#39;ל אופקי הילידים Polyacrylamide ג&#39;ל 4 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת החומרים הדרושים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכשיר ג&#39;ל אופקי, השתמש בתיבת ג&#39;ל (37 ס&quot;מ x 24 ס&quot;מ) עם מגש 27 ס&quot;מ x 21 ס&quot;?...

<ol>
	<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels.">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3.">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li><li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions.">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li><li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus.">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li><li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain.">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li><li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein.">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li><li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators.">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).</li><li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C.">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li><li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis,+cytoskeletal+organization,+and+its+own+expression.">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs.">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li><li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal+C,+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies,+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow.">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li><li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity.">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li><li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays.">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li></ol>

ג &#39;ל polyacrylamide הילידים הם כלי רב ערך לחקר אינטראקציות חלבון- RNA ו באופן מסורתי ג&#39;לים אלה electrophoresed אנכית 2 , 3 . השתמשנו שינוי של פרוטוקול מחליף ג &#39;ל polyacrylamide יליד נוצר electrophoresed אופקית 1 , 4 , 6<...

מבחני מעבר ניידות אלקטרופורטית (EMSAs) הוכיחו להיות כלי ביוכימי שלא יסולא בפז לנתח אינטראקציות ספציפיות לחלבון-חומצה גרעינית 1 , 2 , 3 . מבחני אלה יכולים לספק מידע חשוב לגבי זיקה מחייב של חלבונים ל- RNA או DNA 3 , stoichiometry מרכיב של מתחמי חומצה גרעין 1 ולספק תובנות חדשות חשובות על הייחודיות מחייב של חלבונים RNA מחייב באמצעות ניסויים בתחרות המצע 1 . ההגדרה הניסויית המסורתית עבור מבחני אלה מורכב ערבוב חלבון מטוהרים עם המצע RNA radiolabeled. מתחמי שהתקבלו לאחר מכן מנותחים עם הלא denaturing (יליד) ג &#39;ל polyacrylamide שפכו בין שתי צלחות זכוכית ואחריו electrophoresis מדגם במנגנון אנכי 3. בעוד גישה זו שימשה באופן ממצה כדי לספק תובנות חשובות במנגנונים הביוכימיים שבבסיס מחייב של חלבונים לחומצות גרעין, יש לה גם מספר מגבלות. לדוגמה, לאסטרטגיה בסיסית זו יש תפוקה נמוכה יחסית והיא אינה ניתנת להתאמה בקלות עבור יישומים הדורשים ניתוח של תגובות מחייבות רבות במקביל. בנוסף, עם המנגנון האנכי המסורתי זה מאתגר פוטנציאלי לפקח מתחמים במספר פעמים במהלך אלקטרופורזה 3 , 4 . כאן אנו מציגים הסתגלות של assay EMSA המשתמשת ג &#39;ל polyacrylamide יליד יצוק מכשיר שטוח, אלקטרופורזה אופקית ו fluorescently שכותרתו RNA מצעים 4 , 5 , 6 , 7 . שילובם של שינויים פשוטים יחסית אלהTegy מספק כמה יתרונות חזקים. בפרט, פורמט שטוח אופקי בקלות משאיל את עצמו לנתח עשרות דגימות בו זמנית 4 . כמו כן, עבור כמה מתחמי RNA חלבונים, כגון אלה שנוצרו בין החלבון Bicaudal-C ו אלקטרופורזה המצע RNA שלה בג&#39;ל אופקי מספק יכולת מוגברת כדי לפתור שונים RNA חלבונים מתחמי להפלות אלה ממצע רנ&quot;א מאוגד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1432">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Horizontal Gel Box</td>
			<td style="width:112px;">OWL</td>
			<td style="width:116px;">N/A</td>
			<td style="width:831px;">Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td>
			<td>OWL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerpac 300</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APS</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNAs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein labeled RNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Order can be made custom to length and desired sequence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA tetrasodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5391-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>T8600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483 12 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes

יליד polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי של ביולוגיה מולקולרית אשר שימש בהרחבה לניתוח ביוכימי של אינטראקציות רנ&quot;א חלבון. אינטראקציות אלה ניתחו באופן מסורתי עם ג&#39;ל polyacrylamide שנוצר בין שתי צלחות זכוכית דגימות electrophoresed אנכית. עם זאת, ג &#39;ל polyacrylamide יצוק מגשים electrophoresed אופקית מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, ג &#39;לים אופקי המשמש כדי לנתח מתחמי בין מצעים RNA פלואורסצנטי חלבונים ספציפיים ניתן הדמיה מספר פעמים כמו אלקטרופורזה מתקדמת. זה מספק הזדמנות ייחודית לפקח על מתחמי RNA חלבונים בכמה נקודות במהלך הניסוי. בנוסף, אלקטרופורזה ג&#39;ל אופקית מאפשרת לנתח דוגמאות רבות במקביל. זה יכול מאוד להקל על הניסויים כמובן כמובן, כמו גם ניתוח של מספר רב של תגובות בו זמנית להשוות רכיבים שונים ותנאים. הנה אנחנו יחסי ציבורOvide פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקית אלקטרופורזה הילידים אופקי לניתוח אינטראקציות RNA-Protein.

כדי להדגים את הכוח ואת צדדיות של אופקי הילידים ג &#39;ל אלקטרופורזה ניתחנו את הכריכה של Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) חלבון ל RNA שכותרתו fluorescently המכיל אתר מחייב Bicc1. חלבונים Bicc1 לתפקד כמו mRNA ספציפיים מדכאים translational לשלוט בתאי הגורל החלטות במהלך השלבים האימהיים של ...

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes at JoVE.com

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

יליד polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה היא כלי בסיסי לניתוח אינטראקציות רנ&quot;א חלבון. באופן מסורתי רוב הניסויים השתמשו בג&#39;לים אנכיים. עם זאת, ג &#39;לים אופקית לספק מספר יתרונות, כגון הזדמנות לפקח מתחמי במהלך אלקטרופורזה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפקת ושימוש אופקי גלוקל אלקטרופורזה הילידים.

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...