Name: horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00
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フィギュアを準備してくれたLaura Vanderploegに感謝します。 Sheetsラボでの作業は、NSFグラント1050395とNIHグラント（R21HD076828）によってサポートされています。 Ryderラボの研究は、NIHグラントR01GM117237とR01GM117008によってサポートされています。 Megan Dowdleは、国立衛生研究所（T32GM008349）の全米医科学研究所を通じて、ウィスコンシン大学マディソン大学院大学およびバイオテクノロジー訓練プログラムを通じて、SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowshipの支援を受けています。

水平ネイティブポリアクリルアミドゲルの調製4 。 <ol><li> 必要な材料の準備。 <ol><li>水平ゲル装置の場合は、27cm×21cmのトレイを備えたゲルボックス（37cm×24cm）を使用し、2つの24ウェルコームの容量を使用します。この設定では、合計48個のサンプルを同時に分析できます。 </li><li> 40％アクリルアミド - ビス19：1,5x TBE（Tris-ボレート-EDTA pH8.0）、TEMED、および10?...

<ol>
	<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels.">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3.">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li><li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions.">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li><li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus.">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li><li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain.">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li><li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein.">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li><li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators.">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).</li><li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C.">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li><li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis,+cytoskeletal+organization,+and+its+own+expression.">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs.">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li><li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal+C,+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies,+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow.">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li><li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity.">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li><li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays.">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li></ol>

ネイティブポリアクリルアミドゲルは、タンパク質-RNA相互作用を調査し、伝統的に、これらのゲルを上下に2、3電気泳動するための貴重なツールです。我々が作成され、水平方向に1、4、6、7、15電気泳動ネイティブポリアクリ...

電気泳動移動度泳動シフトアッセイ（EMSA）は、特定のタンパク質-核酸相互作用1、2、3を分析するための貴重な生化学的ツールであることが証明されています。これらのアッセイは、核酸 - タンパク質複合体1の成分化学量論であるRNAまたはDNA 3に対するタンパク質の結合親和性に関する重要な情報を提供し、基質競合実験1を介したRNA結合タンパク質の結合特異性に関する重要な新しい洞察を提供する。 これらのアッセイのための従来の実験装置は、精製されたタンパク質を放射性標識されたRNA基質と混合することからなる。次いで、得られた複合体を、2つのガラスプレートの間に注がれた非変性（天然）ポリアクリルアミドゲルで分析し、次いで垂直装置3でサンプル電気泳動を行う。このアプローチは、タンパク質の核酸への結合の基礎をなす生化学的メカニズムにおける重要な洞察を提供するために徹底的に使用されてきたが、いくつかの制限もある。例えば、この基本戦略はスループットが比較的低く、多くの結合反応を並行して分析する必要がある用途には容易に適応できない。加えて、従来の縦型装置では、潜在的に電気泳動図3、 図4中に複数回に錯体を監視することが困難です。 ここでは、フラットベッド装置で鋳造ネイティブポリアクリルアミドゲル、水平電気泳動および蛍光標識されたRNA基質4、5、6、7を使用するEMSAアッセイの適応を提示します。これらの比較的簡単な変更を基本的なひずみに組み込むことtegyはいくつかの強力な利点を提供します。特に、水平フラットベッドフォーマットは、数十のサンプルを同時に分析するのに適しています4 。また、Bicaudal-Cタンパク質とそのRNA基質との間に形成されるRNA-タンパク質複合体の場合、水平ゲル中での電気泳動は、異なるRNA-タンパク質複合体を分離し、これらを非結合RNA基質から区別する能力を高める。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1432">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Horizontal Gel Box</td>
			<td style="width:112px;">OWL</td>
			<td style="width:116px;">N/A</td>
			<td style="width:831px;">Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td>
			<td>OWL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerpac 300</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APS</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNAs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein labeled RNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Order can be made custom to length and desired sequence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA tetrasodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5391-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>T8600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483 12 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用の生化学的分析に広範に使用されている分子生物学の基本的ツールである。これらの相互作用は、伝統的に、2枚のガラスプレートの間に生成されたポリアクリルアミドゲルおよび垂直に電気泳動されたサンプルで分析されてきた。しかし、ポリアクリルアミドゲルは、トレイにキャスティングされ、水平に電気泳動されると、いくつかの利点をもたらす。例えば、蛍光RNA基質と特定のタンパク質との間の複合体を分析するために使用される水平ゲルは、電気泳動が進行するにつれて複数回画像化することができる。これは、実験中のいくつかの時点でRNA-タンパク質複合体をモニターする独特の機会を提供する。さらに、水平ゲル電気泳動は、多数の試料を並行して分析することを可能にする。これは、時間経過の実験を大幅に促進するだけでなく、複数の反応を同時に分析して、異なる成分および条件を比較することができる。ここで私たちはprRNA-タンパク質相互作用を分析するための水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコルを提供する。

水平ネイティブゲル電気泳動の力と汎用性を実証するために、我々はBicc1結合部位を含む蛍光標識されたRNAをアフリカツメガエル Bicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を分析しました。 Bicc1タンパク質は、動物の開発9の母体段階の間の細胞運命決定を制御するために、mRNAを特異的翻訳リプレッサーとして機能<sup class="xref...

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Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

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タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; - スルホニルカルバモイルアデノシンTcdA機能

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

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