Name: horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00
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우리는 수치를 준비한 Laura Vanderploeg에게 감사드립니다. Sheets 연구소의 연구는 NSF 보조금 1050395 및 NIH 보조금 (R21HD076828)에 의해 지원됩니다. Ryder 연구소의 연구는 NIH 보조금 R01GM117237 및 R01GM117008에서 지원됩니다. Megan Dowdle은 위스콘신 - 매디슨 대학 (University of Wisconsin-Madison) 대학원 및 생명 공학 교육 프로그램을 통해 National Institute of Health (T32GM008349)의 국립 종합 의학 연구소를 통해 SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship의 지원을받습니다.

1. 수평 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔의 제조 4 . <ol><li> 필요한 재료 준비. <ol><li> 수평 겔 장치의 경우 27cm x 21cm 쟁반이있는 젤 상자 (37cm x 24cm)와 2 개의 24 웰 빗용 용량을 사용하십시오. 이 설정은 동시에 분석 할 수있는 총 48 개의 샘플을 제공합니다. </li><li> 40 % Acrylamide-Bis 19 : 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED 및 10 % APS (ammonium persulfate) 시약을 준비하십시오. </li>...

<ol>
	<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels.">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3.">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li><li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions.">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li><li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus.">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li><li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain.">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li><li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein.">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li><li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators.">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).</li><li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C.">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li><li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis,+cytoskeletal+organization,+and+its+own+expression.">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs.">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li><li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal+C,+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies,+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow.">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li><li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity.">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li><li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays.">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li></ol>

네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤은 단백질 -RNA 상호 작용을 조사하는 데 매우 중요한 도구이며 전통적으로이 젤은 수직으로 전기 영동됩니다 2 , 3 . 우리는 생성 된 전기 폴리 아크릴 아마이드 젤을 대체하여 1 , 4 , 6 , 7 , 15로 전...

Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)는 특정 단백질 - 핵산 상호 작용을 분석하는 귀중한 생화학 도구임이 입증되었습니다 1 , 2 , 3 . 이 분석법은 핵산 - 단백질 복합체 1 의 구성 화학 양롞 인 RNA 또는 DNA 3 에 대한 단백질의 결합 친 화성에 관한 중요한 정보를 제공하며 기질 경쟁 실험 1을 통해 RNA 결합 단백질의 결합 특이성에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다 1 . 이 assays에 대한 전통적인 실험 설정은 정제 단백질과 방사성 표지 RNA 기판을 혼합하는 것으로 구성됩니다. 얻어진 복합체는 다음과 비 변성 분석 (네이티브) 폴리 아크릴 아미드 겔은 수직 장치 (3)에 시료 전기 영동 개의 유리판 사이에 붓고. 이 접근법은 핵산에 대한 단백질 결합의 기초가되는 생화학 적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하기 위해 철저하게 사용되었지만 몇 가지 한계점이 있습니다. 예를 들어,이 기본 전략은 상대적으로 처리량이 낮으며 여러 바인딩 반응을 병렬로 분석해야하는 응용 프로그램에는 쉽게 적용 할 수 없습니다. 또한 전통적인 수직 장치의 경우 전기 영동 중 여러 번 복합체를 모니터링하는 것이 어렵습니다 3 , 4 . 여기에서는 평판 장치, 수평 전기 영동 및 형광 표지 된 RNA 기질 4 , 5 , 6 , 7에 주조 된 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 EMSA 분석의 적용을 제시합니다. 기본 스트레인에 대한 이러한 비교적 간단한 변형의 결합tegy는 몇 가지 강력한 이점을 제공합니다. 특히 수평 플랫 베드 형식은 수십 개의 샘플을 동시에 분석하는 데 적합합니다 4 . 또한, Bicaudal-C 단백질과 RNA 기판 사이에 형성된 RNA- 단백질 복합체 (예 : 수평 겔에서 전기 영동)는 서로 다른 RNA- 단백질 복합체를 분해하고 이들을 미 결합 RNA 기질과 구별하는 능력이 향상되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1432">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Horizontal Gel Box</td>
			<td style="width:112px;">OWL</td>
			<td style="width:116px;">N/A</td>
			<td style="width:831px;">Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td>
			<td>OWL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerpac 300</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APS</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNAs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein labeled RNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Order can be made custom to length and desired sequence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA tetrasodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5391-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>T8600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483 12 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용의 생화학 적 분석에 광범위하게 사용 되어온 분자 생물학의 기본 도구입니다. 이러한 상호 작용은 전통적으로 두 개의 유리판 사이에 생성 된 폴리 아크릴 아미드 젤과 수직으로 전기 영동 된 샘플로 분석되었습니다. 그러나, 폴리 아크릴 아미드 겔은 트레이에 캐스팅되고 수평으로 전기 영동 됨으로써 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어, 형광 RNA 기질과 특정 단백질 사이의 복합체를 분석하는 데 사용되는 수평 젤은 전기 영동이 진행됨에 따라 여러 번 이미지화 될 수 있습니다. 이것은 실험 중 여러 지점에서 RNA- 단백질 복합체를 모니터 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한, 수평 겔 전기 영동으로 많은 샘플을 동시에 분석 할 수 있습니다. 이것은 시간 경과 실험을 용이하게 할뿐만 아니라 여러 반응을 동시에 분석하여 여러 구성 요소와 조건을 비교할 수 있습니다. 여기에 우리가 홍보RNA-Protein 상호 작용을 분석하기 위해 수평 고유 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

수평 네이티브 겔 전기 영동의 능력과 다양성을 입증하기 위해 우리는 Bicc1 결합 부위를 포함하는 형광 표지 된 RNA에 Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) 단백질의 결합을 분석했습니다. Bicc1 단백질 mRNA의 특정 리프레 병진 동물 개발 9, 10, 11, 12의 모체 단계뿐만 아니라 성인 <sup class="x...

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Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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