Name: horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes at JoVE.com

Rakamlar hazırladığımız için Laura Vanderploeg&#39;e teşekkür ediyoruz. E-Tablolar laboratuarı çalışması, NSF hibe 1050395 ve NIH hibe (R21HD076828) tarafından desteklenmektedir. Ryder laboratuarı NIH hibe R01GM117237 ve R01GM117008 tarafından desteklenmektedir. Megan Dowdle, National Institutes of Health&#39;in Ulusal Tıbbı Bilimler Ulusal Enstitüsü (T32GM008349) aracılığıyla Wisconsin-Madison Enstitüsü ve Biyoteknoloji Eğitim Programı aracılığıyla SciMed GRS İleri Fırsat Fellowitesi tarafından desteklenmektedir.

1. Yatay Native Poliakrilamid Jelin Hazırlanması 4 . <ol><li> Gerekli malzemelerin hazırlanması. <ol><li> Yatay jel aparatı için 27 cm x 21 cm&#39;lik bir tepsi ve iki adet 24 kuyucuklu tarak için bir jel kutusu (37 cm x 24 cm) kullanın. Bu kurulum, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 örnek sağlar. </li><li> Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:% 40 Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8.0), TEMED ve% 10 APS (amonyum persülfat). </li></ol></li><li> ...

<ol>
	<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels.">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3.">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li><li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions.">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li><li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus.">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li><li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain.">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li><li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein.">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li><li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators.">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).</li><li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C.">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li><li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis,+cytoskeletal+organization,+and+its+own+expression.">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs.">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li><li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicaudal+C,+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies,+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow.">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li><li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity.">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li><li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays.">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li></ol>

Yerli poliakrilamid jelleri, protein-RNA etkileşimlerini araştırmak için paha biçilemez bir araçtır ve geleneksel olarak bu jeller dikey olarak 2 , 3 elektroforez edilir. Doğal poliakrilamid jelleri oluşturan ve yatay olarak elektroforez edilen 1 , 4 , 6 , 7 , 15&#39;in yerini alan bir protok...

Elektroforetik mobilite kayma testleri (EMSA&#39;lar), spesifik protein-nükleik asit etkileşimleri 1 , 2 , 3&#39;ü analiz etmek için paha biçilemez bir biyokimyasal araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahliller, proteinlerin RNA veya DNA 3&#39;e bağlanma afinitesi hakkında önemli bilgi sağlayabilir ve nükleik asit-protein komplekslerinin 1 bileşen stokiyometrisi 1 ve substrat rekabet deneyleri 1 yoluyla RNA bağlama proteinlerinin bağlanma spesifitesi hakkında önemli yeni bilgiler sağlar 1 . Bu deneyler için geleneksel deney düzeneği, saflaştırılmış proteinin radyo-etiketli bir RNA substratı ile karıştırılmasından oluşur. Ortaya çıkan kompleksler daha sonra iki cam levha arasına dökülen denatüre edici olmayan (doğal) poliakrilamid jeller ile, ardından dikey bir cihazda 3 numune elektroforeziyle analiz edilir. Bu yaklaşım, proteinlerin nükleik asitlere bağlanmasının temelini oluşturan biyokimyasal mekanizmalarda önemli bilgiler sağlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmış olmakla birlikte, çeşitli sınırlamaları da vardır. Örneğin, bu temel strateji nispeten düşük işlem hacmine sahiptir ve birçok bağlama reaksiyonunu paralel olarak analiz etmeyi gerektiren uygulamalar için kolayca uyarlanamaz. Buna ek olarak, geleneksel dikey aparat ile elektroforez 3 , 4 sırasında kompleksleri birden çok kez potansiyel olarak izlemek zor. Burada, düz yataklı bir aparatta, yatay elektroforezde ve floresanla etiketlenmiş RNA substratları 4 , 5 , 6 , 7&#39;de yerli poliakrilamid jelleri kullanan EMSA tahlilinin uyarlamasını sunuyoruz. Bu nispeten basit değişikliklerin temel samana dahil edilmesiTegy bazı güçlü avantajlar sağlar. Özellikle yatay masaüstü biçimi, düzinelerce numuneyi eşzamanlı olarak analiz etmeye yardımcı olur 4 . Ayrıca, Bicaudal-C proteini ile RNA substratı arasında oluşan RNA-protein kompleksleri için, yatay bir jelde elektroforez farklı RNA-protein komplekslerini çözmek ve bağlanmamış RNA substrattan ayırmak için artan bir yeteneğe sahiptir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1432">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Horizontal Gel Box</td>
			<td style="width:112px;">OWL</td>
			<td style="width:116px;">N/A</td>
			<td style="width:831px;">Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well large large horizontal gel electrophoresis combs</td>
			<td>OWL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerpac 300</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean II Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APS</td>
			<td>IBI</td>
			<td>IB70080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNAs</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein labeled RNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Order can be made custom to length and desired sequence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA tetrasodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5391-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>T8600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP168-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483 12 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

horizontal gel electrophoresis for enhanced detection of protein-rna complexes

Yerli poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için kapsamlı bir şekilde kullanılan moleküler biyolojinin temel bir araçtır. Bu etkileşimler geleneksel olarak iki cam levha arasında üretilen poliakrilamid jelleri ve numuneler dikey olarak elektroforez ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, tepsilerde dökülen ve yatay olarak elektroforez edilen poliakrilamid jeller çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, flüoresans RNA substratları ve spesifik proteinler arasındaki kompleksleri analiz etmek için kullanılan yatay jeller, elektroforez ilerledikçe birçok kez görüntülene edilebilir. Bu, deney sırasında RNA-protein komplekslerini çeşitli noktalarda izlemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, yatay jel elektroforezi birçok numuneyi paralel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Bu, farklı bileşenleri ve koşulları karşılaştırmak için zamanlama deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırabilir ve aynı anda birden fazla reaksiyonu analiz edebilir. İşte biz prRNA-Protein etkileşimlerini analiz etmek için yatay doğal jel elektroforezi üretmek ve kullanmak için ayrıntılı bir protokolü inceleyin.

Yatay doğal jel elektroforezinin gücü ve çok yönlülüğünü göstermek için Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) proteininin bir Bicc1 bağlanma yeri içeren floresanla işaretlenmiş bir RNA&#39;ya bağlandığını analiz ettik. Bicc1 proteinleri, hayvanlarda gelişme 9 , 10 , 11 , 12&#39;nin maternal evreleri boyunca hücre akıbeti kararlarını kont...

Watch this Scientific Journal Video about Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes at JoVE.com

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...