Name: nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.

1-מאגר וההכנות ציוד <ol><li>להירגע 45 מ ל תא הפרעה פצצות 15 מ"ל צינורות, צינורות ultracentrifugation ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>הכן ולהירגע 25 מיליליטר המגון מאגר לכל התאים 7 2 x 10-4 מעלות צלזיוס. הוסף פרוטאז מעכב טבליה אחת רק לפני השימוש. 
	הערה: מאגרי המגון מכילים אשלגן כלורי בדרך כלל יותר מאשר NaCl טוב יותר...

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation.">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li><li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation.">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li><li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes.">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li><li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells:+composition+and+intracellular+distribution.">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li><li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues.">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li><li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma.">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li><li>Birckbichler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preperation+of+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation.">Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation.</a> TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li><li>Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells.">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li><li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation.">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum.">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li><li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1-interacting+adapter+molecule+(RIAM)+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector.">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking.">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li><li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation.">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li><li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46.">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li><li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event.">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li><li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature,+tubulin+concentration,+and+associated+proteins.">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li></ol>

היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיב?...

החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים, השיוך של חלבוני ממברנה פריפריאלי ממברנות הסלולר הוא הפיך, יכול להיות מוסדר. פונקציית חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים איתות המסלולים וחופש ההתאגדות מוסדר עם ממברנות הוא אחד למנגנון הפעלה או מעכבים שביל. דוגמה אחת של מולקולה איתות הוא חלבון ממברנה פריפריאלי היא GTPase קטן, ראס. לאחר סדרה של שינויים post-translational הכוללות שינוי עם ליפופרוטאין farnesyl, מוסיף ששונה קרבוקסילי של חלבון RAS בוגרת העלעל cytoplasmic של הממברנה התאית. באופן ספציפי, קרום פלזמה היא איפה RAS עוסקת שלה אפקטור במורד הזרם RAF1. כדי למנוע הפעלה המכונן של חלבון מופעל mitogen קינאז (MAPK) מסלול, מספר רמות של שליטה של ראס נמצאים במקום. חוץ עיבוד ראס לא פעיל על-ידי hydrolyzing GTP ל- GDP, ראס הפעיל גם יכול להשתחרר מן קרום פלזמה על-ידי שינויים או אינטראקציות עם solubilizing גורמים כדי לעכב איתות. למרות פלורסנט הדמיה חיה מעניקה תא ביולוגים את ההזדמנות כדי לבחון את ההתאמה subcellular של חלבוני ממברנה פריפריאלי מתויג החלבון הניאון1, נותר צורך קריטי כדי להעריך את קרום התאחדות חלבונים אנדוגני באופן כמותי למחצה עם גישות ביוכימיים פשוטים.
הערכת הביוכימי נאות חלבון מחיצות בין קרום ושברים מסיס הוא ביקורתי תלויה בשני גורמים: המגון הסלולר והפרדה יעיל של קרום ושברים מסיסים. למרות פרוטוקולים מסוימים, כולל ערכות ממוסחר הנפוצה ביותר, תלוי המגון תא מבוססי דטרגנט, שיטות אלה ניתן לערפל ניתוח על-ידי חילוץ קרום חלבונים לתוך מסיסים שלב2. בהתאם לכך, שיטות המבוסס, מכני ללא חומרי לשבירת תאים לספק תוצאות הניקוי. ישנן מספר שיטות של שיבוש מכני של תאים גדלו בתרבות או שנקטפו דם או איברים. אלה כוללים דאונס המגון, הפרעה מחט בסדר, המגון תנודה, sonication קוויטציה חנקן. כאן נוכל להעריך חנקן קוויטציה להשוות אותו בשיטות אחרות. חנקן קוויטציה מסתמך על חנקן אשר התפרקה בציטופלסמה של התאים בלחצים גבוהים. לאחר equilibration, התליה תא חשוף בפתאומיות הלחץ האטמוספרי כך נוצרות בועות חנקן בציטופלסמה זה כשהבנו את התא כתוצאה בתסיסת שלהם. אם הלחץ הוא מספיק גבוה, חנקן בתסיסת יכול לשבש את גרעין3 , ממברנה מאוגדים organelles כמו lysosomes4. עם זאת, אם הלחץ נשמרת נמוכה מספיק, הלחץ ישבש קרום פלזמה ו אר אבל לא organelles אחרים, ובכך לשפוך ציטוזול והן organelles cytoplasmic בשלמותם לתוך homogenate המיועד cavitate5. מסיבה זו, חנקן קוויטציה היא השיטה של בחירה עבור בידוד organelles כמו lysosomes והמיטוכונדריה.
עם זאת, זה גם דרך מצוינת של הכנת homogenate כי ניתן להפריד בקלות לתוך קרום ושברים מסיסים. הספינה לחץ (נקרא מעתה ואילך "הפצצה") ששימש קוויטציה מורכב מעטפת פלדה אל חלד עבה זה עומד בלחץ גבוה, עם מעין שקע בחופו עבור משלוח של הגז חנקן טנק ויציאת שקע עם שסתום פריקה מתכוונן.
חנקן קוויטציה שימש עבור תא המגון מאז שנות ה-606. בשנת 1961, צייד ו Commerfold7 נוסדה קוויטציה חנקן כמו אפשרות מעשית עבור רקמות יונקים השיבוש. מאז, חוקרים יש להתאים את הטכניקה כדי תאים ורקמות שונים עם הצלחה, חנקן קוויטציה הפך למרכיב ביישומים מרובים, כולל ממברנה הכנה8,9, גרעין, אברון הכנה10,11, חילוץ הביוכימי יציב. כעת, ביולוגים תא לעתים קרובות יותר להעסיק בשיטות אחרות של התא המגון כי היתרונות של חנקן המגון יש לא היה נרחב מפורסם, פצצות חנקן יקרים יש תפיסה מוטעית זו מספר גדול יחסית של תאים נדרש. פורסמו הפרוטוקולים עבור חנקן קוויטציה להשגת homogenates נטול תאים עם גרעינים שלמים, הערכות שפורסמו ביותר שימשו כרכים של 20 מ"ל של התא השעיה. להסתגל טכניקה קלאסית זו כדי להתאים לדרישות הנוכחי של עבודה עם דוגמאות בקנה מידה קטן, אנו מציגים פרוטוקול שונה של חנקן קוויטציה שתוכננה במיוחד עבור תאים בתרבית. לאחר קוויטציה חנקן, homogenate מחולק מסיסים (S) ושברים ממברנה (P) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, תחילה עם ספין במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה, ולאחר מכן עם ספין במהירות גבוהה (&#62; g 100,000 x) כדי להפריד בין ממברנות של השבר מסיסים. לנו לנתח את יעילותו של ההפרדה עם immunoblots ולהשוות קוויטציה חנקן עם טכניקות טיפול נוספות שיבושים מכניים. אנחנו גם osmotic חיקרו את השפעת העלאת מאגר המגון במהלך קוויטציה חנקן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Cell Disruption Vessel (45 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Parr Instrument</td>
			<td style="width:145px;">4639</td>
			<td style="width:296px;">Nitrogen cavitation Bomb</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Dounce homogenizer (2 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Kontes</td>
			<td style="width:145px;">885300-0002</td>
			<td style="width:296px;">Dounce pestle and tube</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">U-100 Insulin Syringe 28G&#189;</td>
			<td style="width:181px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td style="width:296px;">Needle</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Atg12 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271688</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-actin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">47778</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">E7-s</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calnexin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">23954</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calregulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373863</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Catalase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271803</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">CIMPR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">124767</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EEA1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">137130</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EGFR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373746</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F0-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">514419</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F1-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">55597</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Fibrillarin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">374022</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Golgin 97 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">59820</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">HDAC1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">81598</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Hexokinase 1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:145px;">2024S</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Lamin A/C antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">376248</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">LAMP1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">H4A3-c</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Na+/K+ ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">48345</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab7 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">137029</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab9 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Thermo</td>
			<td style="width:145px;">MA3-067</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RCAS1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">398052</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RhoGDI antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">360</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Ribosomal protein S6 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">74459</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Sec61a antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">12322</td>
			<td style="width:296px;">Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349622</td>
			<td style="width:296px;">Sample tube for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">TLK-100.3 rotor</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349481</td>
			<td style="width:296px;">rotor for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">364300</td>
			<td style="width:296px;">ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353089</td>
			<td>large cell scraper</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57SIX</td>
			<td>micro stir bar</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S504501AS</td>
			<td>magnetic stirrer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.

איור 2 מציג את חלוקת החלבונים של מערכת העצבים ההיקפית לתוך שבר cytosolic מסיסים (S) או שבר צניפה ממברנה (P). בדקנו שלוש שורות תאים נציג מכל סוגי תאים שונים: HEK-293 (אפיתל) NIH-3T3 (פיברובלסט), Jurkat (לימפוציטים). רו גואנין דיסוציאציה מעכב (RhoGDI), ללא תלות הקטיון מנוז-6-פוספט קו?...

Watch this Scientific Journal Video about Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells at JoVE.com

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...