Name: nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells at JoVE.com

इस काम को GM055279, CA116034 और CA163489 ने वित्तपोषित किया था.

1. बफर और उपकरण तैयारियां <ol> <li> चिल ४५ एमएल सेल व्यवधान बम, 15 मिलीलीटर ट्यूबों, और ultracentrifugation ट्यूबों पर 4 & #176; ग. </li>
	<li> तैयार और चिल homogenization बफर के 25 मिलीलीटर प्रति 2 x 10 7 कोशिकाओं पर 4 & #176; C. बस उपयोग करने से पहले एक ?...

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation.">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li><li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation.">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li><li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes.">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li><li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells:+composition+and+intracellular+distribution.">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li><li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues.">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li><li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma.">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li><li>Birckbichler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preperation+of+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation.">Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation.</a> TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li><li>Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells.">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li><li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation.">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum.">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li><li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1-interacting+adapter+molecule+(RIAM)+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector.">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking.">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li><li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation.">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li><li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46.">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li><li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event.">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li><li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature,+tubulin+concentration,+and+associated+proteins.">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li></ol>

यांत्रिक व्यवधान के अंय तरीकों पर नाइट्रोजन cavitation के लाभ कई गुना हैं । शायद सबसे महत्वपूर्ण लाभ अपने धीरे अभी तक कुशलतापूर्वक homogenize नमूनों की क्षमता है । संपीड़न के भौतिक सिद्धांतों के बजाय अल्ट्रासोनिक...

सेलुलर प्रोटीन दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: उन है कि झिल्ली और उन है कि नहीं कर रहे है के साथ जुड़े रहे हैं । गैर-झिल्ली संबद्ध प्रोटीन organelles के cytosol, nucleoplasm और lumina जैसे endoplasmic जालिका (ईआर) में पाए जाते हैं. वहां झिल्ली के दो वर्गों-जुड़े प्रोटीन, अभिंन और परिधीय हैं । अभिंन झिल्ली प्रोटीन भी transmembrane प्रोटीन के रूप में जाना जाता है क्योंकि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के एक या एक से अधिक क्षेत्रों झिल्ली spans, आमतौर पर एक α के रूप में hydrophobic अमीनो एसिड से बना कुंडलित । Transmembrane प्रोटीन सह-अनुवाद उनके गैर संश्लेषण के दौरान झिल्ली में डाला जाता है और जब तक वे catabolized रहे हैं तो कॉन्फ़िगर किया गया है । परिधीय झिल्ली प्रोटीन secondarily झिल्ली के लिए प्रेरित कर रहे हैं, आमतौर पर इस तरह लिपिड के रूप में hydrophobic अणुओं के साथ पोस्ट-शोधों संशोधन का एक परिणाम के रूप में । अभिंन झिल्ली प्रोटीन के विपरीत, सेलुलर झिल्ली के साथ परिधीय झिल्ली प्रोटीन के संघ प्रतिवर्ती है और विनियमित किया जा सकता है । संकेत रास्ते में कई परिधीय झिल्ली प्रोटीन समारोह, और झिल्ली के साथ विनियमित संघ को सक्रिय करने या एक मार्ग बाधा के लिए एक तंत्र है । एक संकेत अणु कि एक परिधीय झिल्ली प्रोटीन है की एक उदाहरण के छोटे GTPase, रास है । एक farnesyl लिपिड के साथ संशोधन शामिल है कि पोस्ट-शोधों संशोधनों की एक श्रृंखला के बाद, सेलुलर झिल्ली के cytoplasmic पुस्तिका में एक परिपक्व रास प्रोटीन आवेषण के संशोधित सी-टर्मिनस. विशेष रूप से, प्लाज्मा झिल्ली जहां रास अपनी बहाव प्रभाव RAF1 संलग्न है । mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK) मार्ग के गठन सक्रियण को रोकने के लिए, रास के नियंत्रण के कई स्तरों जगह में हैं । सकल घरेलू उत्पाद में hydrolyzing GTP द्वारा रास निष्क्रिय प्रतिपादन के अलावा, सक्रिय रास भी संशोधनों या solubilizing कारकों के साथ बातचीत द्वारा प्लाज्मा झिल्ली से जारी किया जा सकता है संकेतन बाधित । हालांकि फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग मुलाजिम सेल जीव को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पालन करने का अवसर-परिधीय झिल्ली प्रोटीन1टैग, वहां एक महत्वपूर्ण के लिए झिल्ली एसोसिएशन के मूल्यांकन की जरूरत बनी हुई है अंतर्जात प्रोटीन अर्द्ध मात्रात्मक सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ ।
झिल्ली और घुलनशील अंशों के बीच प्रोटीन के विभाजन का उचित जैव रासायनिक मूल्यांकन गंभीर रूप से दो कारकों पर निर्भर है: सेलुलर homogenization और झिल्ली और घुलनशील अंशों का कुशल पृथक्करण । हालांकि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया वाणिज्यिक किट सहित कुछ प्रोटोकॉल, डिटर्जेंट आधारित कोशिका homogenization पर निर्भर करता है, इन तरीकों घुलनशील चरण2में झिल्ली प्रोटीन निकालने के द्वारा विश्लेषण गड़बड़ाने कर सकते हैं । तदनुसार, गैर-डिटर्जेंट आधारित, कोशिका व्यवधान के यांत्रिक तरीके क्लीनर परिणाम प्रदान करते हैं । वहां कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के कई तरीके है या रक्त या अंगों से काटा संस्कृति में उगाया । ये Dounce homogenization, ठीक सुई व्यवधान, गेंद असर homogenization, sonication और नाइट्रोजन cavitation शामिल हैं । यहां हम नाइट्रोजन cavitation का मूल्यांकन और अंय तरीकों से तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation उच्च दबाव के तहत कोशिकाओं के कोशिका में भंग कर रहा है कि नाइट्रोजन पर निर्भर करता है । equilibration के बाद, सेल निलंबन अचानक वायुमंडलीय दबाव ऐसी है कि नाइट्रोजन बुलबुले कोशिका कि आंसू अपने बुदबुदाहट का एक परिणाम के रूप में सेल खोलने में गठन कर रहे है के संपर्क में है । यदि दबाव पर्याप्त उच्च है, नाइट्रोजन बुदबुदाहट नाभिक को बाधित कर सकते हैं3 और झिल्ली बंधे organelles की तरह lysosomes4. हालांकि, अगर दबाव काफी कम रखा है, संपीड़न प्लाज्मा झिल्ली और एर लेकिन नहीं अंय organelles बाधित है, जिससे दोनों cytosol और बरकरार cytoplasmic organelles homogenate कि cavitate5नामित है में फैल जाएगा । इस कारण से, नाइट्रोजन cavitation lysosomes और mitochondria की तरह organelles को अलग करने के लिए पसंद की विधि है ।
हालांकि, यह भी एक homogenate है कि आसानी से झिल्ली और घुलनशील भागों में अलग किया जा सकता है तैयार करने का एक शानदार तरीका है । दबाव पोत (बाद में कहा जाता है "बम") cavitation के दौरान इस्तेमाल एक मोटी स्टेनलेस स्टील आवरण है कि उच्च दबाव झेलने के होते हैं, एक टैंक से नाइट्रोजन गैस के वितरण के लिए एक प्रवेश और एक समायोज्य निर्वहन वाल्व के साथ एक दुकान बंदरगाह के साथ ।
नाइट्रोजन cavitation सेल homogenization के लिए 1960 के दशक के बाद से इस्तेमाल किया गया है6। १९६१ में, हंटर और Commerfold7 स्तनधारी ऊतक व्यवधान के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में नाइट्रोजन cavitation की स्थापना की । तब से, शोधकर्ताओं ने तकनीक को सफलता के साथ विभिंन कोशिकाओं और ऊतकों को अनुकूलित किया है, और नाइट्रोजन cavitation झिल्ली की तैयारी सहित कई अनुप्रयोगों में एक प्रधान बन गया है8,9, नाभिक और organelle तैयारी10,11, और labile जैव रासायनिक निष्कर्षण । वर्तमान में, सेल जीव अधिक बार सेल homogenization के अंय तरीकों को रोजगार क्योंकि नाइट्रोजन homogenization के लाभों को व्यापक रूप से विज्ञापित नहीं किया गया है, नाइट्रोजन बम महंगे है और वहां एक गलत धारणा है कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या है आवश्यक. बरकरार नाभिक के साथ सेल मुक्त homogenates प्राप्त करने के लिए नाइट्रोजन cavitation के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित नहीं किया गया है, और सेल निलंबन के 20 मिलीलीटर के सबसे प्रकाशित मूल्यांकन संस्करणों में इस्तेमाल किया गया । छोटे पैमाने के नमूनों के साथ काम करने की वर्तमान आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए इस क्लासिक तकनीक को अनुकूलित करने के लिए, हम विशेष रूप से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के लिए बनाया गया नाइट्रोजन cavitation का एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । नाइट्रोजन cavitation के बाद, homogenate में घुलनशील (S) और झिल्ली (P) भिन्न है अंतर केंद्रापसारक द्वारा, नाभिक और अटूट कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक कम गति स्पिन के साथ पहले, और फिर एक उच्च गति स्पिन के साथ (& #62; १००,००० x g) अलग करने के लिए घुलनशील अंश से झिल्ली. हम immunoblots के साथ जुदाई की दक्षता का विश्लेषण और अन्य यांत्रिक व्यवधान तकनीक के साथ नाइट्रोजन cavitation की तुलना करें । हम भी नाइट्रोजन cavitation के दौरान homogenization बफर के परासरणी प्रभाव की जांच ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Cell Disruption Vessel (45 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Parr Instrument</td>
			<td style="width:145px;">4639</td>
			<td style="width:296px;">Nitrogen cavitation Bomb</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Dounce homogenizer (2 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Kontes</td>
			<td style="width:145px;">885300-0002</td>
			<td style="width:296px;">Dounce pestle and tube</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">U-100 Insulin Syringe 28G&#189;</td>
			<td style="width:181px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td style="width:296px;">Needle</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Atg12 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271688</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-actin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">47778</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">E7-s</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calnexin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">23954</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calregulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373863</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Catalase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271803</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">CIMPR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">124767</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EEA1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">137130</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EGFR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373746</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F0-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">514419</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F1-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">55597</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Fibrillarin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">374022</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Golgin 97 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">59820</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">HDAC1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">81598</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Hexokinase 1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:145px;">2024S</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Lamin A/C antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">376248</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">LAMP1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">H4A3-c</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Na+/K+ ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">48345</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab7 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">137029</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab9 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Thermo</td>
			<td style="width:145px;">MA3-067</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RCAS1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">398052</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RhoGDI antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">360</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Ribosomal protein S6 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">74459</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Sec61a antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">12322</td>
			<td style="width:296px;">Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349622</td>
			<td style="width:296px;">Sample tube for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">TLK-100.3 rotor</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349481</td>
			<td style="width:296px;">rotor for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">364300</td>
			<td style="width:296px;">ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353089</td>
			<td>large cell scraper</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57SIX</td>
			<td>micro stir bar</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S504501AS</td>
			<td>magnetic stirrer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

प्रसंस्कृत कोशिकाओं परिधीय झिल्ली प्रोटीन सहित प्रोटीन के उपसेलुलर वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग सेलुलर प्रोटीन वितरण के अध्ययन में क्रांति ला दिया है । हालांकि, यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ वितरण, विशेष रूप से जब प्रोटीन आंशिक रूप से cytosolic है यों तो मुश्किल है । इसके अलावा, यह अक्सर अंतर्जात प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । immunoblots जैसे जैव रासायनिक परख सेलुलर अंश के बाद प्रोटीन वितरण के ठहराव के लिए सोने के मानक बने रहते हैं । हालांकि वहाँ वाणिज्यिक किट है कि cytosolic या कुछ झिल्ली भिन्न अलग करने के लिए लक्ष्य कर रहे हैं, इन किट के अधिकांश डिटर्जेंट के साथ निष्कर्षण पर आधारित हैं, जो परिधीय झिल्ली प्रोटीन है कि आसानी से झिल्ली से निकाले जाते हैं का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यहां हम नाइट्रोजन cavitation द्वारा सेलुलर homogenization के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त प्रोटोकॉल वर्तमान और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई । हम विभिंन प्रकार के सेल में घुलनशील और गोली भागों में सेलुलर organelles के जुदाई की पुष्टि करें, और कई आम गैर डिटर्जेंट-आधारित यांत्रिक homogenization तरीकों के बीच प्रोटीन निष्कर्षण की तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation के कई फायदों के बीच नाजुक organelles के लिए न्यूनतम शारीरिक और रासायनिक क्षति के साथ सेलुलर व्यवधान की बेहतर दक्षता है । ultracentrifugation के साथ संयुक्त, नाइट्रोजन cavitation cytosolic और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के बदलाव की जाँच करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि है ।

चित्रा 2 या तो घुलनशील cytosolic अंश (ओं) या झिल्ली गोली अंश (पी) में पीएन से सेलुलर प्रोटीन के विभाजन से पता चलता है । हम विभिंन प्रकार के सेल से तीन प्रतिनिधि सेल लाइनों की जांच: HEK-२९३ (उपक...

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Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

यहां हम डिटर्जेंट के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल homogenization स्तनधारी नाइट्रोजन cavitation और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई के आधार पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के मुक्त । यह विधि घुलनशील और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की निगरानी के लिए आदर्श है ।

नाइट्रोजन Cavitation और अवकलन केंद्रापसारक संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

एक पानी में तेल पायस की centrifugation द्वारा विशालकाय Vesicles encapsulating microspheres की तैयारी

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em&gt; राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em&gt; एपिथेलियल पेट कोशिकाओं

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

वास्तविक समय में बरकरार, कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

झिल्ली प्रोटीन को लक्षित करने वाले कार्यात्मक विश्लेषण और एंटीबॉडी विकास के लिए प्रोटियोलिपोसोम का सेल-मुक्त उत्पादन

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...