Name: nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00
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1 バッファーと機器の準備 <ol><li>4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c</li>。
	<li>準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ 。
	注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バ?...

<ol>
	<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+on+the+move:+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies.">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li><li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling.">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li><li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation.">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li><li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation.">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li><li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes.">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li><li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells:+composition+and+intracellular+distribution.">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li><li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues.">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li><li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma.">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li><li>Birckbichler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preperation+of+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation.">Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation.</a> TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li><li>Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells.">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li><li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation.">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum.">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li><li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1-interacting+adapter+molecule+(RIAM)+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector.">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking.">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li><li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation.">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li><li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46.">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li><li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event.">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li><li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature,+tubulin+concentration,+and+associated+proteins.">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li></ol>

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では?...

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質1の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。
タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ2に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核3を破壊できる、膜バインド リソソーム4のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate5を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。
しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。
窒素のキャビテーションは 1960 年代6以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold7は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備10、11、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (&#62; 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Cell Disruption Vessel (45 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Parr Instrument</td>
			<td style="width:145px;">4639</td>
			<td style="width:296px;">Nitrogen cavitation Bomb</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Dounce homogenizer (2 mL)</td>
			<td style="width:181px;">Kontes</td>
			<td style="width:145px;">885300-0002</td>
			<td style="width:296px;">Dounce pestle and tube</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">U-100 Insulin Syringe 28G&#189;</td>
			<td style="width:181px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td style="width:296px;">Needle</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Atg12 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271688</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-actin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">47778</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">&#946;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">E7-s</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calnexin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">23954</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Calregulin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373863</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Catalase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">271803</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">CIMPR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">124767</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EEA1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">137130</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">EGFR antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">373746</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F0-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">514419</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">F1-ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">55597</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Fibrillarin antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">374022</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Golgin 97 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">59820</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">HDAC1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">81598</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Hexokinase 1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:145px;">2024S</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Lamin A/C antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">376248</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">LAMP1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">DSHB</td>
			<td style="width:145px;">H4A3-c</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Na+/K+ ATPase antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">48345</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab7 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Abcam</td>
			<td style="width:145px;">137029</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Rab9 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Thermo</td>
			<td style="width:145px;">MA3-067</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RCAS1 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">398052</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">RhoGDI antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">360</td>
			<td style="width:296px;">Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Ribosomal protein S6 antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">74459</td>
			<td style="width:296px;">Mouse antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Sec61a antibody</td>
			<td style="width:181px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:145px;">12322</td>
			<td style="width:296px;">Goat antibody, use at 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349622</td>
			<td style="width:296px;">Sample tube for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">TLK-100.3 rotor</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">349481</td>
			<td style="width:296px;">rotor for ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:145px;">364300</td>
			<td style="width:296px;">ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:393px;">cOmplete protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353089</td>
			<td>large cell scraper</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Magnetic Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57SIX</td>
			<td>micro stir bar</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ceramic-Top Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S504501AS</td>
			<td>magnetic stirrer</td>
		</tr>
	</tbody>
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nitrogen cavitation and differential centrifugation allows for monitoring the distribution of peripheral membrane proteins in cultured cells

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾ?...

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Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...