Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

We bedanken M. Douglas Benson voor de eerste gesprekken over secundaire paletbeelden. We erkennen ook David Castaneda-Castellanos (Leica) en Chris Rieken (Zeiss) voor hun hulp om beeldvormende omstandigheden in confocale microscopie aan te passen. We waarderen Lynsey Hamilton (Bitplane) voor nuttige suggesties voor kwantitatieve beeldanalyse met behulp van Imaris-software. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NIDCR R01 DE025887.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van de Universiteit van Californië bij de Institutional Animal Care and Use Committee van San Francisco. 1. Voorbereiding van Live Imaging Media <ol><li> Bereiding van vloeibare kweekmedia <ol><li> Voeg 20% ​​foetaal runder serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, 200 μg / ml L-ascorbinezuur, 15 mM HEPES toe aan Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

Live beeldvorming van weefselmorfogenese met 3D-organische explantatiecultuur kan gedetailleerde informatie verschaffen over cellulaire processen die niet kunnen worden aangetoond in conventionele kleuranalyse van vaste weefselsecties. Met behulp van in vitro explant cultuur van muis embryonale secundaire verhemelte, we observeren verschillende interessante cellulaire gedragingen die ons leiden tot een nieuw mechanisme van verhemelte fusie die epitheliale convergentie en cel extrusie omvat. <p class="jove_c...

Weefselfusie is een belangrijke stap in de ontwikkeling van meerdere organen. Grote menselijke geboorteafwijkingen zoals gespleten lip en verhemelte, spina bifida en misvormingen van het hart kunnen het gevolg zijn van gebreken in weefselfusie 1 . Muis secundaire palet fusie is uitgebreid bestudeerd om de cellulaire en moleculaire mechanismen die weefselfusie in ontwikkeling 2 , 3 , 4 bepalen, te identificeren. In de muis begint secundaire paletontwikkeling bij ongeveer E11.5 met de uitgroei van een secundaire palatale plank uit elk van de bilaterale maxillaire processen. De initiële groei van de palatale planken vindt verticaal langs de tong plaats, tot ongeveer E14.0, op dat moment worden de palatale planken horizontaal boven de tong verhoogd. Mediaal gerichte groei resulteert in fysiek contact tussen de toepassende epithelia van de twee palatale planken, waardoor de middelste epithelie vormtAl Seam (MES) op E14.5. De tussenliggende MES moet verwijderd worden tussen de secundaire palatale planken om mesenchymale samenvloeiing mogelijk te maken en de ontwikkeling van een intact, volledig gesmolten secundair verhemelte door E15.5 3 te ontwikkelen . Hoe is een gedeelde epitheliale MES cellaag gevormd tussen twee afzonderlijke palatale planken, en vervolgens verwijderd om mesenchymale samenvloeiing te bereiken, is een centrale vraag in de ontwikkeling van de verhemelte. Gebaseerd op histologische en elektronenmicroscopie (EM) studies, explorante cultuurstudies en functionele muisgenetische experimenten, zijn er in dit proces verschillende fundamentele celgedragen betrokken. Filopodia-achtige projecties van het mediale randepitheel MEE van elke palatale plank vergemakkelijkt het eerste contact 5 , 6 , gevolgd door intercalatie van deze epitheliale cellen naar een gedeelde single MES 6 , 7 . Verwijdering van de resulterende gedeelde MESIs voorgesteld om door drie niet-exclusieve mechanismen te gaan. Vroege studies waarbij histologische observaties en ex vivo lijnsporen met vitale kleurstoffen werden gebruikt, wijzen erop dat het MES kan worden verwijderd door epitheliale tot mesenchymale overgang (EMT) van MES-cellen 8 , 9 , alhoewel recentere genetische afstamming van epitheliale cellen onzekerheid heeft opgedaan met betrekking tot De langetermijnbijdrage van epitheelcellen aan de palatale plank mesenchymme 10 , 11 , 12 . Significante aantallen apoptotische cellen, en een vermindering van hun aantal in sommige mutanten die geen goede palatefusie ondergaan, heeft geleid tot het idee dat apoptose een belangrijke aandrijving van MES-oplossing 2 , 3 kan zijn . Ten slotte, oorspronkelijk gebaseerd op studies met epitheliale etikettering en statische observatie bij progressieve tijdpunten, MES-cellenWerden voorgesteld om te migreren in de oronasale en anteroposterior afmetingen 11 , 13 , maar dergelijke dynamische celgedragen waren aanvankelijk onbevestigd doordat ze niet in staat waren om ze in levend palatale weefsel te observeren. Onlangs waren we in staat om deze gedragingen direct te observeren door een nieuwe live imaging methodologie te ontwikkelen die muisgenetische methoden van fluorescerende etikettering combineert met confocale livebeelden van explanted palatale planken. Ten eerste, voor het visualiseren van dynamisch cellulair gedrag in gomepitheelcellen tijdens de gomfusie , genereren we een epitheliale-specifieke reportermuis door ROSA26-mTmG floxmuizen met Keratin14-cre muizen 14 , 15 te oversteken. Confocale levende beeldvorming van de verhemelte-explorante cultuur van de resulterende embryo&#39;s bevestigde een aantal eerder voorgestelde cellulaire gedragingen en geïdentificeerde nieuwe gebeurtenissen in het fusieproces 6 </sup&gt;. Epitheliale celmembraan uitsteeksels voorafgegaan aan initieel cel-celcontact gevolgd door epitheelconvergentie door celintercalatie en oronasale celverplaatsing. In het bijzonder ontdekten we dat cel extrusie, een proces dat belangrijke rollen speelde in epitheliale homeostase, een belangrijk mechanisme was om muis secundaire paletfusie 6 , 16 te beheren. Deze beeldvormingsmethode kan gebruikt worden bij andere reporterlijnen; We hebben Lifeact-mRFPruby transgene muizen 17 , 18 gebruikt om actin cytoskeletale dynamiek te onderzoeken tijdens het fusieproces. Andere verslaggevers kunnen ook worden gebruikt om andere specifieke aspecten van verhemeltefusie te observeren en deze methode kan worden aangepast aan laserscanning-confocal microscopie of draaibare confocal microscopie, afhankelijk van beeldbehoeften en beschikbaarheid van microscoop. Live imaging wordt steeds meer een keystone-aanpak in ontwikkelingsbiologie. PartiCulariofaciale morfogenese is complex en menselijke geboorteafwijkingen die het gezicht beïnvloeden zijn gebruikelijk. Deze confocal live imaging methode zal bijdragen tot een beter inzicht in onderliggende basisontwikkelingsmechanismen, alsmede de oorsprong van menselijke craniofaciale afwijkingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

De fusie van de secundaire palatale planken om het intacte secundaire verhemelte te vormen is een belangrijk proces bij zoogdierenontwikkeling en de verstoring ervan kan leiden tot gespleten secundair verhemelte, een gemeenschappelijke aangeboren afwijking bij mensen. Secundaire smaakfusie is uitgebreid bestudeerd, wat leidt tot verschillende voorgestelde cellulaire mechanismen die dit proces kunnen bemiddelen. Deze studies zijn echter meestal uitgevoerd op vaste embryonale weefsels bij progressieve tijdstippen tijdens de ontwikkeling of in vaste explantieve culturen die zijn geanalyseerd op statische tijdstippen. Statische analyse is beperkt voor de analyse van dynamische morfogenetische processen, zoals een gomfusie en welke soorten dynamische cellulaire gedragingen palatal fusie bemiddelen is onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een protocol voor livebeelden van ex vivo secundaire paletfusie in muisembryo&#39;s. Voor het onderzoeken van cellulaire gedragingen van verhemeltefusie werd epitheliale-specifieke Keratin14- cre gebruikt om palaatepitheliale cellen in ROS te labelenA26-mTmG flox reporter embryo&#39;s. Voor het visualiseren van filamenteactine werden Lifeact-mRFPruby- reportermuizen gebruikt. Live beeldvorming van secundaire verhemelingsfusie werd uitgevoerd door dissecteren van recent gehandhaafde secundaire palatale planken van embryonale dag (E) 14.5 stadium embryo&#39;s en culturen in agarose bevattende media op een glasbodemschotel om beeldvorming met een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken. Met behulp van deze methode hebben we een verscheidenheid aan nieuwe cellulaire gedragingen ontdekt tijdens secundaire paletfusie. Een waardering voor het onderscheidend gedrag van de cellen in ruimte en tijd draagt ​​bij aan ons inzicht in dit dynamische morfogenetische proces. Dit protocol kan worden toegepast op mutante muislijnen, of culturen die worden behandeld met farmacologische remmers om verder te begrijpen hoe secundaire paletfusie gecontroleerd wordt.

Live imaging of palate explant cultuur onthulde meerdere cellulaire processen mediating palate fusion 6 . Initiële contacten tussen twee epitheelcellen worden gemaakt door membraanuitsteeksels ( Figuur 2 B-2E ). Wanneer twee epitheliale lagen elkaar ontmoeten vormen ze een multi-cel gelaagde MES, gevolgd door intercalatie om een ​​geïntegreerde enkele cellaag MES te vormen door epitheliale convergentie ( <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiatie van Mature spiervezels voor Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering van Humanized Botmarg Microenvironments in Mouse en hun visualisatie door Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...