Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
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Nous remercions M. Douglas Benson pour des conversations initiales concernant l&#39;imagerie palatine secondaire. Nous reconnaissons également David Castaneda-Castellanos (Leica) et Chris Rieken (Zeiss) pour leur aide pour ajuster les conditions d&#39;imagerie en microscopie confocale. Nous apprécions Lynsey Hamilton (Bitplane) pour des suggestions utiles pour l&#39;analyse d&#39;image quantitative utilisant le logiciel Imaris. Ce travail a été financé par NIH / NIDCR R01 DE025887.

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles de l&#39;Université de Californie au Comité de soins et d&#39;utilisation des animaux institutionnels de San Francisco. 1. Préparation des supports d&#39;imagerie en direct <ol><li> Préparation de milieux de culture liquide <ol><li> Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline, 100 μg / mL de streptomycine, 200 μg / mL d&#39;acide L-...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. 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Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

L&#39;imagerie en direct de la morphogenèse des tissus avec la culture d&#39;explants organiques en 3D peut fournir des informations détaillées concernant les processus cellulaires qui ne peuvent pas être démontrés dans l&#39;analyse de coloration conventionnelle des coupes de tissus fixes. En utilisant la culture d&#39;explants in vitro du palais secondaire embryonnaire de souris, nous avons observé plusieurs comportements cellulaires intéressants qui nous conduisent à proposer un nouveau mé...

La fusion tissulaire est une étape importante dans le développement d&#39;organes multiples. Les principaux défauts de naissance humains tels que la fente de la lèvre et du palais, la spina bifida et les malformations du cœur peuvent résulter de défauts de fusion tissulaire 1 . La fusion secondaire du palais de la souris a été largement étudiée pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la fusion tissulaire dans le développement 2 , 3 , 4 . À la souris, le développement secondaire du palais commence à environ E11.5 avec la décroissance d&#39;une étagère palatine secondaire de chacun des processus maxillaires bilatéraux. La croissance initiale des étagères palatines se produit verticalement le long de la langue, jusqu&#39;à environ E14.0, date à laquelle les étagères palatines sont élevées horizontalement au-dessus de la langue. La croissance axée sur la médiation entraîne un contact physique entre l&#39;épithélium des deux étagères palatines, formant l&#39;épithélium de la ligne médianeAl seam (MES) à E14.5. Les MES intermédiaires doivent être éliminés entre les étagères palatines secondaires pour permettre la confluence mésenchymateuse et le développement d&#39;un palais secondaire intact, complètement fusionné par E15.5 3 . La façon dont une couche cellulaire MES épithéliale partagée est formée entre deux étagères palatines distinctes, puis retirée pour atteindre la confluence mésenchymateuse, a été une question centrale dans le développement du palais. Sur la base d&#39;études de microscopie histologique et électronique à la souris (EM), d&#39;études de culture d&#39;explants et d&#39;expériences génétiques de génétique de souris, plusieurs comportements cellulaires fondamentaux ont été impliqués dans ce processus. Les projections semblables à celles de Filopodia provenant de l&#39;épithélium de bord médian MEE de chaque étagère palatine facilitent le contact initial 5 , 6 , suivie de l&#39;intercalation de ces cellules épithéliales à un MES 6 , 7 partagé. Suppression du MES partagé résultantA été proposé de procéder par trois mécanismes non exclusifs. Les premières études utilisant l&#39;observation histologique et le traçage de lignage ex vivo avec des colorants vitaux ont indiqué que le MES pourrait être éliminé par la transition épithéliale à la mésenchyme (EMT) des cellules MES 8 , 9 , bien que plus récemment, le traçage génétique des cellules épithéliales avait soulevé une incertitude quant à La contribution à long terme des cellules épithéliales au mésenchyme palatins 10 , 11 , 12 . Un nombre important de cellules apoptotiques et une réduction de leur nombre dans certains mutants qui ne subissent pas une fusion appropriée du palais ont conduit à l&#39;idée que l&#39;apoptose peut être un facteur majeur de dissolution MES 2 , 3 . Enfin, basé initialement sur des études portant sur l&#39;étiquetage épithélial et l&#39;observation statique à des points de temps progressifs, les cellules MESOnt été proposés pour migrer dans les dimensions oronasales et antéro-postérieures 11 , 13 , mais ces comportements cellulaires dynamiques étaient initialement non confirmés en raison d&#39;une incapacité à les observer dans le tissu palatal vivant. Récemment, nous avons pu observer directement ces comportements en développant une nouvelle méthodologie d&#39;imagerie en direct qui combine les méthodes génétiques de souris du marquage fluorescent avec l&#39;imagerie radiale confocale des étagères palatines explantées. Tout d&#39;abord, pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques dans les cellules épithéliales du palais lors de la fusion palatine, nous avons généré une souris journalière épithéliale spécifique en traversant des souris ROSA26-mTmG flox avec des souris Keratin14-cre 14 , 15 . L&#39;imagerie confocale en direct de la culture d&#39;explants de palais des embryons résultants a confirmé certains comportements cellulaires précédemment proposés et identifié des événements nouveaux dans le processus de fusion 6 </Sup&gt;. Les protubérances de la membrane cellulaire épithéliale ont précédé le contact cellulaire initial et la convergence épithéliale par intercalation cellulaire et déplacement de cellules oronasales. Notamment, nous avons également découvert que l&#39;extrusion cellulaire, un processus signalé pour jouer un rôle important dans l&#39;homéostasie épithéliale, était un mécanisme majeur qui conduisait la fusion du palais secondaire à la souris 6 , 16 . Cette méthode d&#39;imagerie peut être utilisée avec d&#39;autres lignes de journalistes; Nous avons utilisé des souris transgéniques Lifeact-mRFPruby 17 , 18 pour examiner la dynamique du cytosquelette de l&#39;actine pendant le processus de fusion. D&#39;autres reporters peuvent également être utilisés pour observer d&#39;autres aspects spécifiques de la fusion du palais, et cette méthode peut être adaptée soit à la microscopie confocale à balayage laser, soit à la microscopie confocale, selon les besoins d&#39;imagerie et la disponibilité du microscope. L&#39;imagerie en direct devient de plus en plus une approche clé dans la biologie du développement. PartiEn particulier, la morphogenèse craniofaciale est complexe et les anomalies congénitales humaines qui affectent le visage sont fréquentes. Cette méthode d&#39;imagerie en direct confocal aidera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de développement de base ainsi que les origines des anomalies craniofaciales humaines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

La fusion des étagères palatines secondaires pour former le palais secondaire intact est un processus clé dans le développement de mammifères et sa perturbation peut conduire à une fente de palais secondaire, une anomalie congénitale commune chez l&#39;homme. La fusion du palais secondaire a été largement étudiée, ce qui a mené à plusieurs mécanismes cellulaires proposés qui peuvent servir de médiation à ce processus. Cependant, ces études ont été principalement réalisées sur des tissus embryonnaires fixes à des points de temps progressifs pendant le développement ou dans des cultures d&#39;explants fixes analysées à des points de temps statiques. L&#39;analyse statique est limitée pour l&#39;analyse des processus morphogénétiques dynamiques, telle que la fusion palatine et les types de comportements cellulaires dynamiques médiates de la fusion palatine est incomplètement comprise. Nous décrivons ici un protocole pour l&#39;imagerie en direct de la fusion de palais secondaire ex vivo dans des embryons de souris. Pour examiner les comportements cellulaires de la fusion palatine, la Kératin14 -cre spécifique à l&#39; épithélium a été utilisée pour étiqueter les cellules épithéliales du palais dans ROSA26-mTmG flox reporter des embryons. Pour visualiser l&#39;actine filamenteuse, des souris journalistes Lifeact-mRFPruby ont été utilisées. L&#39;imagerie en direct de la fusion palatine secondaire a été réalisée en disséquant des étagères palatins secondaires récemment adhérentes d&#39;embryons de stade embryonnaire (E) 14,5 et de culture dans des milieux contenant de l&#39;agarose sur un plat de verre pour permettre l&#39;imagerie avec un microscope confocal inversé. En utilisant cette méthode, nous avons détecté une variété de nouveaux comportements cellulaires lors de la fusion palatine secondaire. Une appréciation de la façon dont les comportements cellulaires distincts sont coordonnés dans l&#39;espace et le temps contribue grandement à notre compréhension de ce processus morphogénétique dynamique. Ce protocole peut être appliqué à des lignées de souris mutantes ou à des cultures traitées avec des inhibiteurs pharmacologiques afin de mieux comprendre la façon dont la fusion palatine secondaire est contrôlée.

L&#39;imagerie vivante de la culture d&#39;explants de palais a révélé de multiples processus cellulaires médiant la fusion du palais 6 . Les contacts initiaux entre deux cellules épithéliales sont réalisés par protrusion membranaire ( figure 2 B-2E ). Lorsque deux couches épithéliales se rencontrent, elles forment une MES multicouches multicouches suivie d&#39;une intercalation pour réaliser une MES intég...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Ici, nous présentons un protocole pour l&#39;imagerie en direct de la fusion palatine secondaire de souris à l&#39;aide d&#39;une microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé en combinaison avec une variété de lignes de souris rapporteurs fluorescentes et avec des inhibiteurs de voie pour une vision mécaniste. Ce protocole peut être adapté pour l&#39;imagerie en direct dans d&#39;autres systèmes de développement.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

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