Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

אנו מודים למ &#39;דאגלס בנסון לשיחות ראשוניות בנושא הדמיה משנית של החיך. כמו כן, אנו מודים דוד Castandeda-Castellanos (לייקה) וכריס Rieken (Zeiss) על עזרתם כדי להתאים את תנאי הדמיה במיקרוסקופ confocal. אנו מעריכים את Lynsey Hamilton (Bitplane) להצעות מועילות לניתוח תמונות כמותי באמצעות תוכנת Imaris. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NIDCR R01 DE025887.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת. 1. הכנת מדיה הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה תרבותית נוזלית</strong...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

הדמיה חיה של morphogenesis רקמות עם 3D תרבות explant איבר יכול לספק מידע מפורט לגבי תהליכים תאיים כי לא ניתן להציג ניתוח מכתים קונבנציונלי של קטעי רקמה קבועה. שימוש בתרבות explant חוץ גופית של החיך העכברי העכבר העכבר, ראינו כמה התנהגויות הסלולר מעניין מוביל אותנו להציע מנגנון ...

היתוך רקמות הוא צעד חשוב בפיתוח של איברים מרובים. מומים מולדים אנושיים עיקריים כגון שפה שסועה וחך, ספינה ביפידה ומומים של הלב יכולים לנבוע מליקויים בהרכב רקמות 1 . עכבר חך היתוך משני כבר למד בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים הסלולר השליטה היתוך רקמות בפיתוח 2 , 3 , 4 . בעכבר, פיתוח החיך המשני מתחיל סביב E11.5 עם תולדה של מדף palatal משני מכל אחד התהליכים הבילטראליים דו צדדי. הגידול הראשוני של המדפים paltal מתרחשת אנכית לאורך הלשון, עד E14.0 בערך, אז, המדפים paltal להיות מורם אופקית מעל הלשון. תוצאות רפואיות מכוונות מבחינה רפואית במגע פיזי בין אפיתל ההטיה של שני המדפים הפאלטליים, המרכיבים את האפיתלי של קו האמצעאל תפר (MES) ב E14.5. MES המתערב יש להסיר בין המדפים paltal משני כדי לאפשר מפגש mesenchymal ופיתוח של החיך המשני שלם, התמזגו לחלוטין על ידי E15.5 3 . איך משותף אפיתל תא MES שכבת נוצר בין שני מדפים נפרדים paltal, ולאחר מכן הוסר כדי להשיג confluency mesenchymal, כבר שאלה מרכזית בפיתוח החיך. בהתבסס על מחקרים מיקרוסקופיים של עכברים ומיקרוסקופים אלקטרומגנטיים (EM), מחקרי תרבות אקספאנטיים וניסויים פונקציונליים של גנטיקה של עכברים, מספר התנהגויות תא בסיסיות היו מעורבים בתהליך זה. פילופודיה כמו תחזיות מן האפיתל קצה המדיאלי MEE של מדף כל palatal מאפשר מגע ראשוני 5 , 6 , ואחריו intercalation של תאים אלה אפיתל משותף MES 6 , 7 . הסרת MES המשותף שהתקבלהוצע להמשיך בשלושה מנגנונים לא בלעדיים. מחקרים מוקדמים המעסיקים תצפיות היסטולוגיות ושושלת אקסו vivo עוקבים אחר צבעים חיוניים הצביעו על כך שה- MES יכול להיות מוסר על ידי אפיתל ל- mesenchymal transtemal (EMT) בתאי MES 8 , 9 , אם כי לאחרונה, מעקב גנטי אחר של תאי אפיתל העלה את אי-הוודאות לגבי התרומה ארוכת הטווח של תאים אפיתל המדף palesalyme 10 , 11 , 12 . מספר משמעותי של תאים אפופטוטיים, וכן ירידה במספר מוטציות מסוימות שלא מצליחים לעבור היתוך החיך הנכון הוביל לרעיון כי אפופטוזיס עשוי להיות נהג מרכזי של MES פירוק 2 , 3 . לבסוף, מבוסס בתחילה על מחקרים מעורבים תיוג אפיתל תצפית סטטית ב timepoints פרוגרסיבי, תאים MESהוצעו להגר בממדים 11 ו -13 , 13 , 13 , אך התנהגויות תא דינמיות כאלה לא אושרו בתחילה בשל חוסר היכולת להתבונן בהן ברקמה חיה. לאחרונה, הצלחנו לבחון באופן ישיר את ההתנהגויות הללו על ידי פיתוח מתודולוגיה חדשה של הדמיה חיה המשלבת שיטות גנטיות עכבר של תיוג פלואורסצנטי עם הדמיה חיה confocal של מדפים paltal explanted. ראשית, כדי לחזות התנהגויות הסלולר דינמיות בתאי האפיתל חיך במהלך היתוך חיך, יצרנו עכבר עיתונאי ספציפי האפיתל על ידי חציית ROSA26-mTmG עכברי flox עם Keratin14-Cre עכברי 14, 15. Confocal הדמיה חיה של החיך explant התרבות של העוברים שהתקבלו אישר כמה התנהגויות הסלולר הציע בעבר זיהו אירועים רומן בתהליך היתוך 6 </22pl אפיתל בליטות הממברנה התא קדמו קשר תא תא ראשוני ואחריו התכנסות אפיתל ידי intercalation התא ו תזוזה תא אורונצלי. ראוי לציין, גילינו גם כי שחול התא, תהליך דיווחו לשחק תפקידים חשובים בהומיאוסטזיס אפיתל, היה מנגנון מרכזי נהיגה חיך העכבר החיך המשני 6 , 16 . שיטה זו הדמיה ניתן להשתמש עם שורות כתב אחרים; אנו ניצלו Lifeact-mRFPruby עכברים מהונדסים 17 , 18 לבחון את הדינמיקה cytoskeletal אקטין במהלך תהליך היתוך. כתבים אחרים יכולים לשמש גם כדי לבחון היבטים ספציפיים אחרים של היתוך החיך ואת שיטה זו ניתן להתאים גם לייזר מיקרוסקופ סריקה מיקרוסקופית או ספינינג דיסק confocal, בהתאם לצרכים הדמיה וזמינות מיקרוסקופ. הדמיה חיה הופכת יותר ויותר לגישה של קיסטון בביולוגיה התפתחותית. Partiבאופן חלקי, מורפוגנזה craniofacial מורכבת ומומים מולדים אנושיים המשפיעים על הפנים הם נפוצים. שיטה זו הדמיה חיה confocal יעזור לאפשר הבנה משופרת של מנגנוני התפתחות בסיסיים הבסיסית כמו גם מקורות של הפרעות craniofacial האדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

ההיתוך של המדפים הפלטליים המשניים כדי ליצור את החיך המשני השלם הוא תהליך מפתח בהתפתחות יונקים והפרעותיו יכולות להוביל לחיך משני שסוע, אנומליה מלידה נפוצה אצל בני אדם. מיצוי החיך המשני נחקרה בהרחבה ומובילה למספר מנגנונים סלולריים מוצעים שעשויים לתווך את התהליך. עם זאת, מחקרים אלה בוצעו בעיקר על רקמות עובריים קבוע בשעה timepoints פרוגרסיבי במהלך הפיתוח או בתרבויות explant קבוע ניתח על נקודות זמן סטטיות. ניתוח סטטי מוגבל עבור ניתוח של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים כגון היתוך החיך ואילו סוגים של התנהגויות הסלולר דינמי לתווך היתוך palatal אינו מובן לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך vivo לשעבר משני עוברים עכבר. כדי לבחון התנהגויות הסלולר של היתוך החיך, אפיתל ספציפי קראטין 14-Cre שימש התווית חיך אפיתל תאים ב ROSA26-mTmG עובר לכתב flox. כדי להמחיש אקטין נימי, עכברים LifeACT-mRFPruby כתב שימשו. הדמיה חיה של היתוך החיך המשניים בוצעה על ידי לנתח לאחרונה מדבקות paltal משני דבקו של היום עובריים 14.5 שלב ו culturing ב המכילים agarose התקשורת על צלחת תחתית זכוכית כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ confocal הפוך. באמצעות שיטה זו, גילינו מגוון רחב של התנהגויות הסלולר הרומן במהלך היתוך החיך המשני. הערכה של התנהגויות תאים ברורים מתואמים בחלל ובזמן תורמת רבות להבנתנו את התהליך המורפוגנטי הדינמי הזה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכבר מוטציה קווים, או תרבויות שטופלו מעכבי פרמקולוגי כדי לקדם את ההבנה מראש של איך פיוזון החיך המשני נשלטת.

הדמיה חיה של החיך explant תרבות חשף תהליכים סלולריים מרובים מתווכים היתוך החיך 6 . הקשר הראשוני בין שני תאים אפיתל מבוצעים על ידי בליטות הממברנה ( איור 2 B-2E ). כאשר שני שכבות אפיתל נפגשים, הם יוצרים מרובת תאים מרובד MES ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

יציקת כלי דם של ריאות עכבר מבוגר ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיית מיקרו-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...