Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
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Ringraziamo M. Douglas Benson per le prime conversazioni riguardanti l&#39;imaging secondario del palato. Riconosciamo anche David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) per il loro aiuto per regolare le condizioni di imaging in microscopia confocale. Apprezziamo Lynsey Hamilton (Bitplane) per suggerimenti utili per l&#39;analisi quantitativa di immagini utilizzando il software Imaris. Questo lavoro è stato finanziato da NIH / NIDCR R01 DE025887.

Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell&#39;Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali. 1. Preparazione di Media Live Imaging <ol><li> Preparazione di supporti di coltura liquida <ol><li> Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DME...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

L&#39;imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell&#39;esplosivo dell&#39;organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la co...

La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale 1 . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo 2 , 3 , 4 . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l&#39;espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l&#39;E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l&#39;epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l&#39;epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 3 . Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall&#39;epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale 5 , 6 , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES 6 , 7 condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall&#39;epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES 8 , 9 , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l&#39;incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale 10 , 11 , 12 . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all&#39;idea che l&#39;apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES 2 , 3 . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l&#39;etichettatura epiteliale e l&#39;osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior 11 , 13 , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l&#39;etichettatura fluorescente con l&#39;imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati. In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin 14 -cre 14 , 15 . L&#39;imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione 6 </sup&gt;. Le protuberanze della membrana delle cellule epiteliali hanno preceduto il contatto cellulare iniziale seguito da convergenza epiteliale mediante intercalazione delle cellule e spostamento delle cellule oronasali. Notevolmente, abbiamo anche scoperto che l&#39;estrusione cellulare, un processo segnalato per svolgere ruoli importanti nell&#39;omeostasi epiteliale, è stato un meccanismo importante che porta la fusione dei palati secondari del mouse 6 , 16 . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby 17 , 18 per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell&#39;atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L&#39;imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L&#39;analisi statica è limitata per l&#39;analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG flox reporter. Per visualizzare l&#39;actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L&#39;imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l&#39;imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.

L&#39;imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Qui presentiamo un protocollo per l&#39;imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l&#39;intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all&#39;immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

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