Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
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2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.

모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 라이브 영상 미디어 준비 <ol><li> 액체 배양 배지의 제조 <ol><li> 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어. <br /...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. 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Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다. 이러한 유?...

조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 . 공유 상피 MES 세포층이 2 개의 분리 된 구개 선반 사이에 형성되고,이어서 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 제거되는 방법은 구개 발달에서 중심적인 문제였다. 마우스 histological 및 전자 현미경 (EM) 연구, explant 문화 연구 및 기능 마우스 유전학 실험을 바탕으로, 몇 가지 기본적인 세포 행동이 과정에 연루되었습니다. 각 선반 구개의 내측 가장자리 상피에서 MEE Filopodia 형 돌기는 공유 단일 MES 6,7 이러한 상피 세포의 인터이어서 초기 접촉 (5, 6)을 용이하게한다. 결과 공유 MES 제거세 가지 비 독점적 인 메커니즘으로 진행하도록 제안되었습니다. 조직 학적 관찰과 중요한 염료로 추적 체외 계보를 사용하는 초기 연구는 MES는 MES 세포의 중간 엽 전환 (EMT)로 상피에 의해 제거 될 수 있습니다 8, 9,하지만 최근, 상피 세포의 유전 적 혈통 추적이에 대한 불확실성을 제기했다고 표시 palatal shelf mesenchyme 10 , 11 , 12 에 대한 상피 세포의 장기적인 기여. 현저한 수의 세포 사멸 세포와 적절한 미각 융합을 거치지 못하는 일부 돌연변이 체에서의 세포 수 감소는 세포 사멸이 MES 용해 2 , 3 의 주요 동인이 될 수 있다는 생각으로 이어진다. 마지막으로, 점진적 시점에서 상피 표지 및 정적 관찰을 포함하는 연구에 기초하여, MES 세포구강 및 전후 치수 11 , 13 에서 이동하는 것이 제안되었지만, 이러한 동적 세포 행동은 초기에 생 구개 조직에서 관찰 할 수 없기 때문에 미확인이었다. 최근 우리는 구강 구강 선별의 공 촛점 라이브 영상과 형광 라벨링의 마우스 유전자 방법을 결합한 새로운 라이브 이미징 방법론을 개발함으로써 이러한 행동을 직접 관찰 할 수있었습니다. 첫째, 구개 융합 동안 구개 상피 세포의 동적 세포 행동을 시각화하기 위해, 우리는 Keratin14-CRE 마우스 14, 15 ROSA26 - mTmG flox 마우스를 교차하여 상피 별 기자 마우스를 생성합니다. 결과 배아의 구개 explant 문화의 공 촛점 라이브 이미징 일부 이전에 제안 된 세포 행동을 확인하고 융합 과정 6 에서 새로운 이벤트를 확인 </sup&gt;. 상피 세포 막 돌출부는 초기 세포 - 세포 접촉에 이어 세포 삽입 및 구강 세포 변위에 의한 상피 수렴이 뒤 따른다. 특히, 우리는 또한 세포 압출, 상피 항상성에 중요한 역할을하는 것으로보고 프로세스를 발견, 마우스 차 구개 융합 (6), (16)를 운전하는 주요 메커니즘이었다. 이 이미징 방법은 다른 기자 회선과 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 융합 과정에서 액틴 세포 골격 역학을 검사하기 위해 Lifeact-mRFPruby 형질 전환 마우스 17 , 18 을 사용했습니다. 다른 기자는 또한 구개 융합의 다른 특정 측면을 관찰하는 데 사용할 수 있으며이 방법은 이미징 요구 및 현미경 가용성에 따라 공 촛점 현미경 검사 또는 회전 디스크 공 촛점 현미경 검사에 맞게 조정할 수 있습니다. 생체 영상은 발달 생물학에서 핵심적인 접근 방법이되고 있습니다. 이상적 상대cularly, craniofacial morphogenesis는 복잡하고 얼굴에 영향을 미치는 인간의 선천적 결함은 일반적입니다. 이 공 촛점 라이브 이미징 방법은 인간의 craniofacial 이상의 기원뿐만 아니라 근본적인 기본 발달 메커니즘의 향상된 이해를 활성화하는 데 도움이됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.

구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세?...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

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라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

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장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

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In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

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후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...