Name: live imaging of mouse secondary palate fusion
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Vi takker M. Douglas Benson for innledende samtaler om sekundær gane-bildebehandling. Vi anerkjenner også David Castaneda-Castellanos (Leica) og Chris Rieken (Zeiss) for deres hjelp til å justere bildeforhold i konfokal mikroskopi. Vi setter pris på Lynsey Hamilton (Bitplane) for nyttige forslag til kvantitativ bildeanalyse ved hjelp av Imaris-programvare. Dette arbeidet ble finansiert av NIH / NIDCR R01 DE025887.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokollene fra University of California ved San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Forberedelse av Live Imaging Media <ol><li> Fremstilling av flytende dyrkningsmedier <ol><li> Tilsett 20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 200 μg / ml L-askorbinsyre, 15 mM HEPES til Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media. MERK: Live-bilde...

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

Levende avbildning av vevsmorfogenese med 3D organteksplanteringskultur kan gi detaljert informasjon om cellulære prosesser som ikke kan vises i konvensjonell fargingsanalyse av faste vevseksjoner. Ved å bruke in vitro eksplanterende kultur av musemuskulær sekundær gane, observerte vi flere interessante cellulære oppføringer som førte oss til å foreslå en ny mekanisme av ganefusjon som involverer epitelkonvergens og celleekstrudering. En felles utfordring i studier av denne...

Vevsfusjon er et viktig skritt i utviklingen av flere organer. Store menneskelige fødselsdefekter som spalt leppe og gane, spina bifida og misdannelser i hjertet kan skyldes mangler i vevsfusjon 1 . Mus sekundær gane fusjon har blitt grundig studert for å identifisere de cellulære og molekylære mekanismer som styrer vev fusjon i utvikling 2 , 3 , 4 . I musen begynner sekundær ganeutvikling på rundt E11.5 med utvækst av en sekundær palatal hylle fra hver av de bilaterale maksillære prosessene. Den første veksten av palatalhyllene foregår vertikalt langs tungen, til omtrent E14.0, på den tiden blir palatalhyllene løftet horisontalt over tungen. Medialt rettet vekst resulterer i fysisk kontakt mellom den appellerende epitel av de to palatale hyllene, som danner midtre epitheliAl seam (MES) på E14.5. Den mellomliggende MES må fjernes fra de sekundære palatale hyllene for å tillate mesenkymal sammenfylling og utviklingen av en intakt, fullstendig smeltet sekundær gane ved E15.5 3 . Hvordan et felles epithelial MES-cellelag dannes mellom to separate palatale hyller, og deretter fjernet for å oppnå mesenkymal konfluens, har vært et sentralt spørsmål i ganeutvikling. Basert på mus histologiske og elektronmikroskopi (EM) studier, eksplante kulturstudier og funksjonelle musegenetiske eksperimenter, har flere grunnleggende celleatferd vært involvert i denne prosessen. Filopodi-lignende fremspring fra medialkantenepitelet MEE av hver palatal hylle muliggjør første kontakt 5 , 6 , etterfulgt av interkalering av disse epitelceller til en delt enkelt MES 6 , 7 . Fjerning av den resulterende delte MESHar blitt foreslått å fortsette med tre ikke-eksklusive mekanismer. Tidlige studier med histologisk observasjon og ex vivo linjesporing med vitale farger indikerte at MES kan fjernes ved epitel til mesenchymal overgang (EMT) av MES-celler 8 , 9 , men nylig har genetisk linjesporing av epitelceller økt usikkerheten om Det langsiktige bidraget fra epitelceller til palatal hylle mesenchym 10 , 11 , 12 . Signifikant antall apoptotiske celler, og en reduksjon av antallet i noen mutanter som ikke klarer å gjennomgå riktig gnagefusion, har ført til ideen om at apoptose kan være en viktig driver for MES oppløsning 2 , 3 . Til slutt, basert på studier med epitelmerking og statisk observasjon ved progressive tidspunkter, MES-cellerBle foreslått å migrere i oronasale og anteroposterior dimensjonene 11 , 13 , men slike dynamiske celleatferdigheter var i utgangspunktet ubekreftet på grunn av manglende evne til å observere dem i levende palatalvev. Nylig var vi i stand til å observere disse oppføringene direkte ved å utvikle en ny levende bildebehandling som kombinerer musegenetiske metoder for fluorescerende merking med konfokal levende bildebehandling av eksplanterte palatalhyller. For å visualisere dynamisk cellulær oppførsel i ganeepitelceller under ganefusjon genererte vi en epitel-spesifikk reportermus ved å krysse ROSA26-mTmG floxmus med Keratin14-cre mus 14 , 15 . Konfokal levende bildebehandling av ganeeksplanteringskulturen av de resulterende embryoer bekreftet noen tidligere foreslåtte cellulære oppføringer og identifiserte nye hendelser i fusjonsprosessen 6 </sup&gt;. Epiteliale cellemembranfremspring foregikk før første cellecellekontakt etterfulgt av epitelial konvergens ved celleinterkalering og oronasal celleforskyvning. Spesielt oppdaget vi også at celleekstrudering, en prosess som rapporterte å spille viktige roller i epithelial homeostase, var en viktig mekanisme som kjørte mus sekundær ganefusjon 6 , 16 . Denne avbildningsmetoden kan brukes med andre reporterlinjer; Vi benyttet Lifeact-mRFPruby transgene mus 17 , 18 for å undersøke aktin cytoskeletaldynamikk under fusjonsprosessen. Andre journalister kan også benyttes for å observere andre spesifikke aspekter ved ganefusjon, og denne metoden kan tilpasses enten til laserskanning av konfokal mikroskopi eller spoleplate-konfokal mikroskopi, avhengig av bildebehov og mikroskoptilgjengelighet. Live imaging blir stadig en keystone tilnærming i utviklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenese er kompleks og menneskelige fødselsskader som påvirker ansiktet er vanlige. Denne konfokale levemodellmetoden vil bidra til å muliggjøre en bedre forståelse av underliggende grunnleggende utviklingsmekanismer, samt opprinnelsen til menneskelige kraniofaciale abnormiteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

Fusjonen av de sekundære palatalhyllene for å danne den intakte sekundære ganen er en sentral prosess i utvikling av pattedyr, og forstyrrelsen kan føre til spalt sekundær gane, en vanlig medfødt anomali hos mennesker. Sekundær ganefusjon har blitt grundig studert, noe som fører til flere foreslåtte cellulære mekanismer som kan mediere denne prosessen. Imidlertid har disse studiene blitt utført hovedsakelig på faste embryonale vev ved progressive tidspunkter under utvikling eller i faste eksplosive kulturer analysert ved statiske tidspunkter. Statisk analyse er begrenset for analyse av dynamiske morfogenetiske prosesser som en ganefusjon, og hvilke typer dynamisk cellulær oppførsel medierer palatal fusjon er ufullstendig forstått. Her beskriver vi en protokoll for levende bildebehandling av ex vivo sekundær ganefusjon i musembryoer. For å undersøke cellulær oppførsel av ganefusjon ble epitel-spesifikk Keratin14- cre brukt til å merke ganeepitelceller i ROSA26-mTmG flox reporter embryoer. For å visualisere filamentøs actin ble Lifeact-mRFPruby- reportermus brukt. Levende bildebehandling av sekundær ganefusjon ble utført ved å dissekere nylig adhered sekundære palatal hyller av embryonale (E) 14.5 stadium embryoer og dyrking i agaroseholdige medier på en glassbunnskål for å muliggjøre avbildning med et invertert konfokalmikroskop. Ved å bruke denne metoden har vi oppdaget en rekke nye cellulære atferd under sekundær ganefusjon. En forståelse for hvor forskjellig celleatferd er koordinert i rom og tid, bidrar sterkt til vår forståelse av denne dynamiske morfogenetiske prosessen. Denne protokollen kan brukes på mutante muselinjer, eller kulturer behandlet med farmakologiske hemmere for ytterligere å forstå forståelsen av hvordan sekundær ganefusjon styres.

Levende avbildning av ganeeksplanteringskulturen avslørte flere cellulære prosesser som mediterer ganefusjon 6 . Initielle kontakter mellom to epitelceller er laget av membranfremspring ( Figur 2 B-2E ). Når to epitel lag møtes, danner de en flerkellet lagdelt MES etterfulgt av interkalering for å lage et integrert enkeltcellelag MES gjennom epitelial konvergens ( Figur 2 A-2...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Her presenterer vi en protokoll for levende bildebehandling av musens sekundære ganefusjon ved hjelp av konfokal mikroskopi. Denne protokollen kan brukes i kombinasjon med en rekke fluorescerende reportermuslinjer, og med banehemmere for mekanistisk innsikt. Denne protokollen kan tilpasses for levende bildebehandling i andre utviklingssystemer.

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The overall goal of this confocal live imaging method is to directly observe the cellular processes, the drive's secondary palate fusion during cranial facial development. Begin by separating the head from the body of the embryo under a dissecting microscope in a petri dish containing fresh, room temperature PBS. Grasp the head with one pair of fine number five forceps and use a second pair of forceps to remove the upper brain, cutting away any extra tissue outside of the palatal shelves with a second pair of forceps.Remove the mandible carefully without damaging the palatal shelves. When the mandible has been detached, carefully remove the tongue and confirm the presence of a robust reporter signal in the midline epithelia seam. It's important not to damage it, palatal explained during dissection to keep the midline epithelia seam intact.Next, remove the hind brain, brain stem and both maxilli with the adhered palatal shelves. Cut the anterior upper jaw tissue, keeping both the primary and secondary palates intact. Remove the nasal septum on the nasal side of the explant to expose the midline epithelia seam and confirm that the epithelia layer between the tissue is intact.Now, add live imaging medium to a 35 millimeter glass bottom dish and place the dissected palatal shelves, oral side down in the dish as close to the glass bottom as possible. Then, place dry ice pellets on a conductive surface near the culture dish to expedite the solidification of the agarose within the imaging medium. When the agarose is semi-solid, mount the culture dish in an inverted confocal microscope equipped with a 37 degree celsius incubation chamber and use a syringe to apply petroleum jelly between the culture dish and the culture cover to prevent evaporation of the imaging medium.Select a low magnification objective to locate the region of interest. Then, select a high magnification objective and scan multiple z stacks with five micron steps for 16 to 24 hours, using the appropriate laser excitation. Live imaging of palate explant culture reveals multiple cellular processes that mediate palate fusion, with the initial contacts between the two epithelia cells being made by membrane protrusions.When the two epithelia layers meet, they form a multi cell layered midline epithelia seam, followed by intercalation to generate an integrated single cell layer, midline epithelia seam through epithelia convergence. The epithelia cells in deeper z levels are also progressively displaced to the oral side of the midline epithelia seam, contributing to the epithelia convergence process. Posterior directed cell migration is observed in middle palate midline epithelia seam.With epithelia cell extrusion events observed during palate fusion, suggesting that the epithelia cells in the midline epithelia seam can be removed by this active process. This integrated epithelia seam will ultimately break down to achieve confluency. Further, filamentis actin becomes enriched at the border between the epithelia and mazenkemo areas, forming a cable like structure along the anterior posterior axis.Software can be used to track specific cellular behaviors of interest, during palate fusion with the best method for cell tracking depending on the reporter signal used in the experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differensiering av Eldre Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsiktig live Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulær støping av voksne og tidlige postnatale muslunger for micro-CT-bildebehandling

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Disseksjon og live-imaging av sen embryonal drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...